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案例一 单精子全基因组测序探索染色体重组
Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single
Sperm Cells by Whole-Genome Sequencing
期刊：Science
影响因子：33.611
发表单位：北京大学
发表年份：2012年12月
一、研究背景
减数分裂期间同源染色体之间存在片段交叉重组（crossover）事件，染色体重组意味着遗传物质的分离交换，是产生生物多态性的重要遗传机制。在全基因组范围内，重组位点并非均匀分布，而是集中在一些散布的狭小区域内（hotspot），并且不同物种以及同一物种不同个体重组位点也存在明显差异。
传统的人类染色体重组研究，采用染色体核型分析技术，受实验技术的限制，分辨率较低；另外，由于一个家庭内的孩子数目有限，以往的研究都是在群体水平上开展的，而无法开展个人水平的遗传重组规律研究。单细胞DNA扩增技术和高通量测序技术的发明，使得测序单个精子的基因组成为可能。
二、方法流程
对一名亚洲男性及其99个精子进行了单细胞全基因组测序
1. Illumina HiSeq 2000
2. 单细胞全基因组测序：
体细胞（70×）；
93个精子（1×）；
6个精子（5×）。
1. 与人类参考基因组（hg19）进 行比对
2. SNP检测
3. 单体型分析
三、研究结果
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1. SNP检测及重组定位
检测到SNP约2.8M个，其中约1.4M个为杂合SNP。同时分析变异计算重组率，约1.1M的杂合SNP进行了定位，构建了迄今为止重组定位精度最高的个人遗传图谱， 定位的准确率为99.5%。研究发现个体水平上基因区附近的重组率有降低的现象，证明了这一现象是由分子机制决定，而非自然选择的结果。 -
2. 染色体非整倍性
本研究还发现5%的精子（4个）染色体数目发生异常，即染色体组非整倍体。其中S39精子的19号染色体发生了缺失，S39精子的6号染色体发生了二倍化。 前人研究表明，染色体数目异常是造成某些先天性出生缺陷的重要原因。
四、研究结论
本研究采用多重退火环状扩增循环技术（MALBAC），对一名亚洲男性及其99个精子进行了体细胞及单精子全基因组测序，测序深度分别为70×和1×，构建了个人遗传图谱，并分析减数分裂期间同源染色体之间的片段交叉重组（crossover）事件。研究表明个体水平上基因区附近的重组率降低现象是由分子机制决定，而非自然选择的结果。染色体数目异常是造成某些先天性出生缺陷的重要原因。这一研究结果将有助于研究人类染色体重组规律，探索先天性出生缺陷的遗传机理。
案例二 单细胞测序揭示肝癌组织中T细胞浸润全景图
Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing
期刊：Cell
影响因子：30.409
发表单位：北京大学、首都医科大学
发表年份：2017年6月
一、研究背景
中国是肝癌高发国家，术后生存率较低。之前相关研究报道肝癌组织内含有大量的肿瘤浸润淋巴细胞，而针对肝癌免疫治疗方法的研究少之又少。通过深刻探究肝癌的肿瘤免疫微环境来发现新的肿瘤免疫疗法，寻找新的靶点和有效的生物标志物，对于肝癌的诊断和治疗具有重大意义。
二、方法流程
4名男性肝癌患者和2名女性肝癌患者的外周血样本以及肿瘤/正常组织
Illumina HiSeq 4000
WES：肿瘤组织和正常组织
RNA-seq：5063个单细胞
TCR-seq： 3792个T细胞
与人类参考基因组进行比对
检测Somatic mutation和拷贝数变异
聚类分析和克隆结构分析
TCGA数据库数据比对分析
三、研究结果
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1.肿瘤特征和单个T细胞测序
通过全外显子和转录组测序分析肝癌患者的基因组突变特征，检测结果与已知的肝癌基因组模型相似；利用免疫组织化学实验来描绘不同T细胞亚型； 进而从不同组织的单细胞悬浮液中对CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+ T细 胞进行分类。 -
2.T细胞聚类和亚型分析
利用SC3光谱聚类法将所有的T细胞聚类得到11个cluster，其中5个cluster为CD8+T细胞亚群，6个cluster为CD4+T细胞亚群， 每个细胞亚群都有其独特的基因表达状态。其中，CD8+T细胞群中，耗竭性CD8+T细胞在肿瘤组织中的表达比例显著增多；而在CD4+T细胞群中， C6_CD4-CCR7细胞中SELL，TCF7和CCR7的表达较高。 -
3.肝癌免疫微环境研究
结合TCR测序证实肝癌内存在大量的肿瘤组织特异的克隆增生性T细胞，但是这些细胞大多处于耗竭状态，这揭示了肿瘤细胞逃逸免疫监视的机制。 此外，该研究展示了初始T细胞向耗竭状态的进展方式，并在耗竭性CD8+T细胞亚群中发现了一类FOXP3+抑制性T细胞的存在，提出了耗竭性 T 细胞会进一步向 抑制性 T 细胞的潜在方向发展。
四、研究结论
本文通过全外显子测序，转录组测序以及免疫组库测序技术，针对外周血和肿瘤组织中分离出的5063个T细胞和6名肝癌患者邻近正常组织的单个细胞进行联合检测分析，发现基因Layilin 在杀伤性CD8+T细胞和抑制性T细胞这两群细胞中均特异性表达；体外实验证实该基因对于CD8+T细胞的杀伤功能有抑制调节作用；免疫微环境分析揭示了肿瘤发生免疫逃逸机制，该项研究为后续创立新的肝癌免疫疗法奠定了一定的基础。
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