单细胞Flex、微生物单细胞

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单细胞技术拓展（FLex、微生物）

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送样建议

单细胞Flex—打破新鲜样本研究壁垒，扩展样本研究边界

单细胞基因表达Flex，即单细胞Fixed RNA可对甲醛固定后的样本进行高灵敏度的全转录组分析，通过特异性探针杂交捕获细胞中的mRNA，实现单细胞基因表达量的检测；同时支持混样建库，同批次操作分析，最大限度减少实验可变性和批次效应。经过优化的产品流程将单细胞样本研究范围扩大到新鲜样本、FFPE样本，让单细胞转录组的研究更加灵活。本技术针对人的约18,000+编码基因设计了成对的特异性探针，其中一段探针（RHS）的一端带有人工合成的pCS 1序列，用于Gel Beads上Oligo序列的捕获，另一段探针（LHS）设计了pRead 2S序列，用于文库构建和测序；同时根据探针上的Probe Barcode序列，可进行混样标记，最多可混样标记16个样本。

产品优势

1.拓展拓展样本研究边界，延长样本等待时间
2.支持混样建库，方便样本进行批量分析
3.特异性探针设计，高灵敏度捕获全转录组
4.百万级细胞通量，混样降低实验成本

应用方向

✓ 肿瘤异质性研究
✓ 干细胞分化以及组织器官发育研究
✓ 神经系统发育研究
✓ 免疫方向研究
✓ 疾病分型及用药指导

信息分析

获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，通过如下流程进行生物信息分析。单细胞转录组的分析核心是细胞的分群和亚群差异基因的鉴定，使用10x官方分析软件Cell Ranger及第三方软件Seurat对细胞进行分型和差异分析，后续对这些差异基因进行功能富集，从而鉴定亚群的功能特征。

常见问题

1. 单细胞Flex的杂交探针对是如何设计的？
- 单细胞Flex技术覆盖了人的18,532个编码基因，大多数基因为3倍探针对的覆盖；7.5%的基因如高表达基因和线粒体蛋白编码基因为1倍探针对覆盖；其中TCR连接和可变区、IG连接和可变区、核糖体蛋白、线粒体核糖体蛋白、读通基因、KIR和HLA基因(由于其固有的等位基因多样性)及非编码RNA被排除在人类探针组之外。
2. 单细胞Flex对样本有什么要求？
- Flex可对新鲜样本、FFPE样本进行单细胞研究。新鲜样本建议保存于组织保存液中寄送，由诺禾致源进行样本细胞悬液制备及固定，固定后的样本可于-80℃冰箱保存半年；FFPE样本建议冰袋寄送石蜡块至诺禾致源，样本需进行DV200质检，DV200>30%的样本可继续进行细胞核解离操作，石蜡卷实验使用量为25um 4-6张。
3. 可以应用4%多聚甲醛自行固定细胞吗？
- 建议新鲜样本制备、悬液固定操作由诺禾致源进行，实验人员对于操作流程更为熟悉，且Flex对于固定时间有相同要求，统一操作更规范化；且10x固定试剂除多聚甲醛外，包含透化酶等其他试剂，如客户必需进行自行固定处理，建议使用10x官方固定试剂。
4. 关于混样建库，RNA含量相差较大的样本，可以混池建库吗？
- 不建议RNA含量相差大的样本共同进行混池建库。在混池测序过程中，测序reads将按其固有RNA含量的比例分布到不同的样品中，所有样品将具有相同的测序饱和度，因此，具有高RNA细胞的样品每个细胞将获得更多的读取，而具有低RNA细胞的样品每个细胞的读取将按比例减少。同时因为混池的原因，无法对单一样本进行精准加测操作。
5. 单细胞Flex可以与空间转录组联合分析吗？
- 建议单细胞Flex产品与空间Visium V2产品进行联合分析，二者同为探针对杂交设计，且使用的探针集相同，同一个样本的数据分析可高度匹配。
6. 单细胞Flex的测序策略是什么
- 应用PE150测序策略，推荐测序数据量为1-2w reads/cell，每个样本约30-50G数据量

VITA微生物单细胞转录组测序产品

微生物单细胞转录组测序产品通过独特的微生物细胞固定透化技术，基于随机引物的微生物转录本原位逆转录技术，和单细胞捕获技术得到微生物的单细胞转录组信息，从而研究体外纯化培养的单个菌种内部的异质性，或胃肠道菌群间的异质性，最终应用于解析菌群内部异质性以及新的亚群鉴定，刺激环境的适应性，耐药研究等方向。 M20 VITA平台微生物单细胞转录组测序的核心原理是对细菌进行固定透化后，使用随机引物与细菌内的RNA结合，对全转录组的RNA分子进行原位逆转录。通过末端转移酶（TdT）将捕获接头添加到cDNA的3’末端。之后，通过VITACruiser单细胞平台进行高通量单细胞标记。在通过cDNA扩增建库和Illumina平台测序后，通过VITASeer对数据进行处理，再通过与参考基因组的比对获得物种信息，最终降维聚类形成细胞分群，并展示样品中的菌种占比。

应用方向

✓ 探究肠道微生物群参与的药物互作、药物代谢
✓ 解析肠道菌群与其他组织器官的关联
✓ 临床耐药研究
✓ 人体胃肠道功能调节相关产品研发
✓ 酶资源的勘探
✓ 胃肠道菌群改善
✓ 生态动力学
✓ 饲料优化

产品优势

1.高分辨率分析：在宏转录组技术的基础上，实现单细胞精度，解析菌体间异质性。
2.应用于原核细胞：将单细胞水平的应用范围从真核细胞拓展到原核细胞，能够对单个微生物细胞的转录组进行深入研究，揭示细菌间的异质性。
3.发现稀有细胞类型：可以检测到数量稀少但具有重要功能的微生物细胞类型。
4.解析微生物的动态变化：检测微生物在不同环境条件或生长阶段的转录组变化。

常见问题

1. 对于细菌的形状、直径大小是否有限制要求？
- 没有限制要求，细菌的直径一般在 0.5~10μm 之间，均符合检测条件。
2. 可以做真菌吗？
- 真菌目前还在研发测试阶段。
3. 单菌的标准是什么，如果一个细菌物种的不同菌株混合，算单菌吗？
- 此处单菌指种水平的一个细菌物种。
4. 需捕获多少细菌进行测序分析，测序量要求多少？
- 单菌细胞数：2000-3000，测序量 30-60G；混菌细胞数：5000-10000，测序量 150-300G。
5. 单细菌转录组中 rRNA 比例有多少，数据可满足后续分析吗？
- 核糖体比例一般为80-90%。细菌的核酸量较小，rRNA损耗的数据有限，30-60G 的测序量可满足单菌的分析。
6. 和细菌 bulk RNAseq 相比，单细菌转录组有什么优势？
- 可研究细菌表达水平的异质性，揭示平均值掩盖的差异。
7. 野生株和点突变改造后的突变株，能检测出的转录水平的差异吗？
- 只要有表达差异，可以检出。
8. MscRNA-seq 能反映细菌丰度吗？与宏转录组测出来的结果一致性如何？
- 可以反映细菌丰度，与宏转录组稍有差异，优势物种相似。
9. 进行单细菌转录组功能分析，需要参考基因组吗？
- 需要。
10. 细菌亚群鉴定后，还需要做功能验证吗？
- 根据研究目的可进行功能验证，如构建荧光报告菌株、流式分选等。
11. 送样前是否可以进行预实验，评估样本是否满足送样需求。
- 细菌固定以后，取 2µL 细菌样本与 198µL 水混合后移至载玻片（可根据实际情况进行稀释），用显微镜观察 200X/400X 视野，评估细菌结团率情况及杂质情况，结团率需 < 20%。