单细胞全长转录组

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单细胞全长转录组

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产品简介

单细胞三代全长转录组测序技术综合了10x Genomics平台的单细胞捕获技术和Nanopore公司的三代全长测序技术，能够读取单细胞转录本的全长信息，不仅能实现二代测序的全部生信分析，还可以在Isoform，融合基因，可变剪接等方向的深入拓展研究。诺禾致源单细胞转录组二代+三代解决方案，利用10x Genomic平台微流控、油滴包裹和 barcode 标记等技术，来实现高通量的细胞捕获和标记，对单细胞mRNA捕获后进行反转录生成cDNA，将同一份cDNA分成两部分，分别构建二代测序文库和三代测序文库；用Illumina和Oxford Nanopore PromethION平台分别对二代和三代转录组文库进行测序；使用10x Genomics官网推荐的相应的分析软件及可视化软件对二代数据进行下游数据分析；使用Oxford Nanopore的wf-single-cell分析流程，对三代数据进行下游分析。

应用方向

✓ 分析不同细胞间转录本的异质性
✓ 探究可变剪接、融合基因形成的原因
✓ 探究Isoform产生的原因
✓ 分析Isoform对细胞/组织功能的影响
✓ ......

诺禾优势

✓ 超过30000例单细胞样本制备经验，丰富完善的各物种样本类型制备方法，全流程一站式服务
✓ 采用2+3技术路线，二代和三代测序应用于同一份样品，提高数据可信度，精准定量转录本
✓ 丰富的单细胞样本制备捕获经验，单细胞三代兼容单细胞二代样本类型
✓ 结合10×单细胞捕获技术，实现了高通量、低成本、高灵敏度的全长序列分析
✓ 检测融合基因信息，可以将融合基因定位到细胞亚群，实现对融合基因所在细胞的基因表达差异研究（融合 vs 非融合），后续可以通过拟时序分析，在分化轨迹中标注融合基因发生的位置，拓展融合细胞的研究范畴
✓ 挖掘功能基因，如膜蛋白、分泌蛋白、转录因子等的转录本使用情况，并发现全新功能转录本（isoform）
✓ 二代测序与三代测序优势互补，基于三代更全面的转录本信息，得到更精细的细胞亚群

生信分析

使用 NanoPlot 对原始数据进行基本质控及数据展示，随后使用wf-single-cell 软件对单细胞三代全长转录组数据进行基本过滤后，比对基因组进行基因及转录本等的定量，再使用 Seurat 软件，直观地展示细胞分群和细胞亚群在TSNE/UMAP上的二维分布以及差异基因和差异转录本的表达情况。后续对这些差异基因进行功能富集，从而鉴定亚群的功能特征，而基于转录本的差异结果可实现不同可变剪切分析。此外还可借助相应数据进行融合基因分析。

常见问题

1. 为什么要做单细胞全长转录组？
- 单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 能够表征来自复杂组织的单个细胞之间的基因表达差异，提供更高分辨率的转录组信息。目前大多数单细胞实验都是使用短读长完成的。由于短读长的片段化，只捕获分子的各端。测序片段只能在基因水平上提供表达信息，缺少可能对疾病或生物功能十分关键的异构体多样性分析。
  而单细胞全长转录组测序，可获得完整mRNA序列，用于对不同mRNA异构体、可变剪切、融合基因等进行分析，随着单细胞研究领域的越来越深入，在癌症、神经生物学、发育生物学、免疫学、基因编辑、耐药研究等方向都有广泛应用前景。
2. 单细胞全长转录组目前支持的样本类型？产品策略推荐？
- 单细胞全长转录组目前不限物种，送样建议与10x单细胞转录组一致，非常规物种为保证数据质量，建议先做单细胞二代转录组，基于二代数据质量良好的基础上，执行单细胞三代建库测序。
  产品策略推荐单细胞“2+3”技术策略，即同一份样本经10x Genomics捕获后，反转录成cDNA；后续将cDNA一分为二，一部分二代建库测序（主要用于基因定量）；一部分进行Oxford Nanopore Technologies三代建库测序（主要用于融合基因/可见剪接/isoform分析）；3.单细胞全长转录组推荐细胞捕获数？数据产出是多少？
  单细胞三代全长转录组测序建议的细胞数为5000-8000，正常情况下，一个单细胞二代转录组样本可对应一个单细胞三代全长转录组测序芯片，单细胞三代数据产出约为80M reads，数据量约80G。
3.单细胞全长转录组推荐细胞捕获数？数据产出是多少？
- 单细胞三代全长转录组测序建议的细胞数为5000-8000，正常情况下，三代测序推荐1张测序芯片（1Cell），产出约为80M reads，数据量约80G。
4. 对于之前已经执行过二代单细胞测序样本，是否可以直接进行Nanopore单细胞三代建库测序？
- 可以，要求如下：（1）捕获试剂类型：10x Genomics 3’ V3.1（2）二代单细胞数据质量良好（3）捕获后的cDNA剩余量≥50ng
  满足以上三点的基础上，可以将该cDNA质检，质检合格后，即可进行Nanopore单细胞三代全长转录组建库测序。