空间转录组（sST）技术继单细胞转录组技术之后被Nature Methods评为2020年的年度技术，近些年基于测序的空间转录组新技术不段涌现，不同平台在技术实现、分辨率、捕获效率和分子扩散等方面存在显著差异，作为发现发育和疾病演进规律，病理诊断的强有效工具，选择合适的空间转录组学平台对于各位专家学者是一项复杂且重要的决策。

2024年7月4日，西湖大学研究团队、广州实验室联合墨尔本大学，哈佛大学研究者等人在Nature Methods期刊上发表了一篇题为“Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods”的研究文章，该实验建立了一套具有明确定义的组织和区域的参考样本，包括小鼠胚胎眼、小鼠脑海马区和小鼠嗅球，生成了跨平台的11种sST方法数据，以评估每种技术在空间分辨率、捕获效率和分子扩散等方面的性能。此外分析发现空间转录组数据展示出独特的特性，不仅仅是在单细胞数据中添加了一个空间轴，在捕获稀有细胞状态和特定标记物方面具有独特优势，本研究还展示了不同的sST技术在聚类、区域注释和细胞间通信等下游应用中具有不同的能力，成果数据建立了一个用于未来基准测试的框架，可作为空间转录组学分析的计算工具开发和基准测试的黄金标准，有助于生物学家选择合适的sST平台。本研究中西湖大学10x visium空间转录组测序服务由诺禾致源提供。

1.实验基准参考组织和实验设计

研究人员选择了11种不同的sST方法，包括微阵列（基于探针和基于polyA的10X Genomics Visium、DynaSpatial）、珠子法（HDST、BMKMANU S1000、Slide-seq V2、Curio Seeker（Curio Bioscience的商业化版本）、Slide-tag）、纳米球法（Stereo-seq、PIXEL-seq、Salus）和微流控法（DBiT-seq），在基准测试流程中，研究人员还标记了点中心之间的距离，以代表平台的物理分辨率。他们发现Stereo-seq、Visium、BMKMANU S1000和Salus能够几乎完整地捕获右脑和整个E12.5胚胎，而Slide-seq V2的捕获能力有限。DBiT-seq的捕获尺寸则取决于微流控通道的宽度，后面将不同方法规范化相同的测序reads总数，生成了计数矩阵来进行了敏感性和扩散计算、细胞状态注释、标记基因检测和细胞间通信分析。

2.分子捕获效率

选定成年小鼠大脑和E12.5小鼠胚胎中的海马区和眼睛组织为分析区域，基于降采样（使不同样本具有相同数量的测序reads）结果，发现不同的sST数据未达到饱和，需要更多的reads才能实现最佳性能，具有潜在的增加灵敏度的可能性，不同统计法比较下各平台有不同的表现，Stereo-seq和Slide-tag在使用所有测序数据时显示出更好的捕获效率，而Slide-seq V2、基于探针的Visium和DynaSpatial在相同的测序深度下表现出更好的捕获效率。此外在基于poly-A的Visium平台上观察到了一种意外的基因捕获偏差，能被其他技术一致检测到的高表达标志基因在Visium数据中未被找到。

3.分子横向扩散

通过小鼠嗅球（Pixel-seq，Stereo-seq，Slide-seqV2）,小鼠脑海马（BMKMANU S1000，Slide-seqV2，Salus，Stereo-seq），小鼠胚胎眼球（BMKMANU S1000，Stero-seq，Slide-seqV2）经典marker（Slc17a7、Ptgds及Pmel）的数据统计分析上来评估分子的横向逸散问题发现Stereo-seq在嗅球和大脑组织的侧向扩散控制方面存在不足，在小鼠眼睛中结果确截然相反，这表明对于分子横向扩散的影响，相比于技术平台，组织类型对扩散过程产生了相当大的影响。另一个因素是渗透时间，结果显示出渗透时间对扩散模式和mRNA捕获有很大影响。

4.聚类结果和区域注释

E12.5小鼠胚胎眼球内部结构复杂，基于对眼部区域内的一般细胞状态有一定的了解，通过比较细胞亚群发现，Slide-seqV2,Stereo-seq表现出了预期结果，BMKMANU S1000在检测细胞状态，特别是识别黑色素细胞时数据表现较差，分析原因可能与数据中的侧向扩散问题有关。而Visium技术则因其较低的物理分辨率和有限的捕获位点数量，在检测预期细胞亚群时受到限制。此外，在注释过程中发现，单纯使用单细胞数据作为参考来标注空间组学数据的分析模式可能存在缺陷，但它作为一个有用的参考数据集可以用于注释sST数据。

5.血液污染敏感性

另一个值得提及的问题是sST技术对血液污染的敏感性，这通常在组织制备和切片过程中引入很难避免。研究以Hba-a1基因作为示例，评估了这些sST方法中血液污染的影响。研究结果发现，Visium、DynaSpatial以及BMKMANU S1000明显受到血液污染的影响，所有Visium和DynaSpatial斑点以及70%的BMKMANU S1000斑点表达Hba-a1。相比之下，Stereo-seq数据与snRNA-seq相比，血液污染的程度相对较低，而Slide-seq V2的血液污染程度最低。

6.跨技术的标记基因检测

研究人员发现每个平台都有比其他平台更多的独特标记基因。这表明每个平台都有其独特的优势和特点，研究人员尝试应用细胞间通信分析方法，包括CellChat、CellPhoneDB v.4和sST方法，但未能找到一致的结果。这可能是因为不同方法之间的差异以及数据集的特点导致了不一致的结果，总的来说，这些结果强调了不同技术选择和抽样对于标记基因的识别和细胞亚群的分离的影响。这些发现对于理解细胞状态的复杂性以及选择合适的分析方法具有重要意义。

7.文章总结

总的来说，该研究生成了第一个系统的sST方法基准评估方案。尽管努力展示了所有技术的最佳表现，但其中一些实验并没有完全优化，例如DBiT-seq和Curio Bio，这意味着它们的数据可能并不代表它们的最佳性能。sST实验通常需要更多的实验技巧，而操作效果也不能忽视。sST领域正在快速发展，随着进一步的优化，每种技术的性能可能会随时间而变化，需要持续评估以跟上这个快速发展的领域。