在全球范围内，心血管疾病（CVD）是导致人类死亡的主要因素之一。其中炎症在许多心血管疾病的发生及进展中起到了关键作用。虽然发现炎症反应过程中巨噬细胞起着重要作用，但心血管疾病中炎症反应的调控机制仍不清楚，导致无法开发更有效的治疗策略。

2024年8月，北京大学药学院姜勇研究团队、首都医科大学附属北京安贞医院杜智勇研究团队在Acta Pharmaceutica Sinica B（IF=14.7）合作发表了题为“A microfluidic coculture model for mapping signaling perturbations and precise drug screening against macrophage-mediated dynamic myocardial injury”的文章。该研究基于微流控芯片模型并通过非靶向代谢组学、脂质组学、qRT-PCR、免疫荧光等技术阐明了心肌损伤的主要机制是炎症和氧化应激反应。并发现该心肌损伤芯片模型能用于潜在治疗药物的筛查，为心血管疾病的药物研发提供了新思路。其中脂质组学检测服务由诺禾致源提供。

研究思路

研究结果

1. 搭建心肌损伤芯片模型

在健康心脏中，巨噬细胞是最丰富的免疫细胞。在心脏损伤期间，巨噬细胞数量会显著增加。活化的巨噬细胞会释放大量炎症介质，导致心肌损伤。为了研究活化巨噬细胞与心肌细胞之间的实时通讯，作者搭建了一个包含8 个结构单元的共培养微流控芯片（图1B）。每个单元包含两个通道和多个连接槽（图1C）。主通道用于培养心肌细胞，侧通道用于培养巨噬细胞（图1D）。接下来在微流控芯片上建立炎症性心脏损伤模型，将活化或对照巨噬细胞分别与心肌细胞实时共培养，作为模型组（Model）或对照组（Control）。发现模型组中心肌细胞活力（Cell viability）降低了10.7%，免疫荧光检测结果显示模型组中死心肌细胞（染成红色）增多且活心肌细胞（染成绿色）的形态收缩（图1E）。并使用DNA 染料Hoechst 33324来表征心肌细胞的凋亡。结果在模型组中心肌细胞显示出更强的蓝色荧光，细胞凋亡率更高，为21.8%（图1F）。

图1 心肌损伤模型的搭建及表征

2. 通过代谢组表明芯片模型能重现体内的病理过程

为了阐明心肌损伤芯片模型可以很好地重现体内炎症及氧化应激相关的病理过程，作者将巨噬细胞与心肌细胞一起置于培养基中建立了心脏损伤模型（CM）作为体外对照。同时以通过注射异丙肾上腺素（ISO）或结扎心脏动脉（LAD）诱导的心肌梗死大鼠模型和急性心肌梗死（AMI）患者作为体内对照。取（1）芯片模型组（Chip Model）及其对照组的细胞裂解物；（2）CM 模型组及其对照组细胞裂解物；（3）ISO组和注射生理盐水的对照组（Saline）大鼠的心脏组织；（4）LAD组和假手术组（Sham）大鼠的心脏组织；（5）AMI 患者组和健康人对照组（Health）的血液，进行非靶向代谢组和脂质组检测（图2A）。五个模型组内模型与对照组间进行差异分析。并绘制了芯片模型组、CM 模型组、ISO及LAD大鼠模型组，AMI组中差异代谢物的变化倍数热图（图2D），显示芯片模型组大多数代谢物变化与ISO、LAD大鼠模型组及AMI组更相似，且芯片模型组比CM模型组检测出更多差异代谢物。在AMI组中显示炎症相关代谢物会显著升高，包括溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、花生四烯酸及其氧化衍生物（12-HETE, 5-HETE, 20-HETE, leukotriene B4）（图2B和C）。而且对比这些炎症相关代谢物的变化，芯片模型组与AMI组的相似性更高，甚至高于ISO、LAD大鼠模型组。对差异代谢物进行通路富集分析，与CM模型组相比，芯片模型组中富集的代谢通路与在大鼠和人类组的富集通路更相似，特别是在炎症和氧化应激相关通路的相似性更高（图2E）。综上所述，通过非靶向代谢组及脂质组检测，表明芯片模型能很好地重现体内炎症及氧化应激相关的病理过程。

图2 五种心肌损伤模型的代谢组学分析

3. 心肌损伤的主要机制是炎症和氧化应激反应

基于非靶向代谢组及脂质组检测结果，作者推测，芯片模型中心肌损伤的主要机制是花生四烯酸通过环氧合酶（COX）、脂氧合酶（Alox）和 CYP450酶（CYP）代谢生成 5-HETE、12-HETE和20-HETE。这个过程可能激活转录因子NF-κB，从而导致炎症因子（NO、TNF-α 和IL-6）的含量增加。也导致溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）和游离脂肪酸（油酸、硬脂酸和棕榈酸）含量的增加，以及促进了活性氧（ROS）的产生。此外，抗氧化分子谷氨酰胺和蛋氨酸含量降低及线粒体中 抗氧化酶（SOD2）表达受抑制，可能会加剧 ROS 积累，从而导致线粒体去极化（即线粒体膜电位降低）（图3A）。以上推测通过分子生物学实验得到了进一步验证，在芯片模型组（Model）中检测到炎症相关基因（COX-2、Alox15、CYP1B1和NF-κB）的表达水平相比于对照组（Control）显著升高（图3B）。此外，与对照组相比，模型组中炎症因子（NO、TNF-α 和IL-6）的含量显著增加（图3C）。而且，在芯片模型的共培养条件下，这些炎症因子的含量随时间逐渐增加，这与心肌梗死的病理过程一致，是活化巨噬细胞持续释放炎症因子导致的（图3D）。通过免疫荧光法，发现模型组中红色荧光显著增加，表明活性氧水平升高（图3E和F）。模型组中绿色荧光的减少表明抗氧化酶的表达降低（图3G）。模型组中含有去极化线粒体的凋亡细胞（绿色）数量显著增加（图3H）。综上所述，基于芯片模型的非靶向代谢组、脂质组和分子生物学检测发现了心肌损伤的主要机制是炎症和氧化应激反应。

图3 心肌损伤的主要机制及验证分析

4. 芯片模型能更有效地筛选治疗心肌损伤的药物

作者进一步将心肌损伤芯片模型应用于体外的药物筛选，用于发现能治疗心肌损伤且具有生物活性的天然产物（图4A）。先通过CM模型的初步筛选，在73 种天然产物中鉴定出的 5 种具有生物活性，包括20(S)-人参皂苷Rg?、甘草酸、人参皂苷 Rd、人参皂苷 Rb?和原儿茶醛。加入这些天然产物后心肌细胞活力显著提高（图4B）。再通过心肌损伤芯片模型进行二次筛选，进一步确定这五种天然产物的疗效，发现只有人参皂苷Rb?和原儿茶醛显著提高了心肌细胞的活力（图4C），免疫荧光结果显示人参皂苷Rb?和原儿茶醛组中活细胞（绿色）占比更大（图4D）。由于心肌损伤芯片模型能很好重现体内的病理过程，所以通过芯片模型可以提高体外药物筛选的准确性。

图4 治疗心肌损伤药物的筛选及分析

5. 药物活性的体内验证

为了进一步说明芯片模型体外药物筛选结果的可靠性，作者将五种天然产物用于治疗ISO诱导的心肌梗死小鼠。ISO组表现出血清中CK-MB酶和乳酸脱氢酶（LDH）含量显著升高，表明心肌损伤。人参皂苷 Rb?和原儿茶醛组血清中CK-MB和LDH含量显著降低，表明它们在体内具有心脏保护活性（图5A和B）。其余三组对心肌损伤无治疗作用。从H&E染色结果可看出与ISO 组相比，五种天然产物组均表现出不同程度组织坏死和炎症浸润。但人参皂苷 Rb?和原儿茶醛组在抑制炎症浸润方面效果更优异（图5C）。此外，人参皂苷Rb?和原儿茶醛组中活性氧含量显著降低，而其余三组对氧化应激没有抑制作用（图5D）。综上所述，小鼠体内实验结果表明，只有人参皂苷Rb?和原儿茶醛能够预防心肌损伤，与芯片模型药物筛选结果一致，说明该芯片模型能用于潜在治疗药物的筛查。

图5 五种药物在体内的药效评价

小编总结

本研究中，作者先搭建了一种体外心肌损伤芯片模型。基于芯片模型并通过非靶向代谢组学、脂质组学、qRT-PCR、免疫荧光等技术阐明了心肌损伤的主要机制是炎症和氧化应激反应。并发现该心肌损伤芯片模型能用于潜在治疗药物的筛查，为心血管疾病的药物研发提供了新思路。

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参考文献：

[1] Z. Gao, Z. Du, Y. Hou, K. Hua, P. Tu, X. Ai and Y. Jiang.A microfluidic coculture model for mapping signaling perturbations and precise drug screening against macrophage-mediated dynamic myocardial injury.Acta Pharmaceutica Sinica B. 2024;14(12):5393-5406.