在已知的黑色素瘤致病基因中，BRAF是最常见的突变驱动基因，它通过持续激活MAPK通路，使肿瘤细胞具备更强的侵袭能力。具有这类突变的患者极易产生耐药性，即使采用BRAF/MEK抑制剂联合方案，仍有70%患者会在两年内出现疾病恶化。因此急需超越MAPK通路的新策略来克服耐药。近年研究发现，耐药性与线粒体功能增强（如氧化磷酸化）有关，提示靶向线粒体是克服耐药的新策略，且铜离子对线粒体功能至关重要。老药双硫仑（Disulfiram，DSF）是一种铜离子载体，能在细胞内络合铜离子并促进其积累，已在多种癌症中显示出抗癌潜力。那么，DSF能否通过铜依赖性方式诱导线粒体功能障碍，从而逆转黑色素瘤耐药呢？

2025年6月，来自南方医科大学皮肤病医院的朱冠男老师团队在顶级期刊Cell Death & Disease（IF=9.6）发表题为“Exploiting mitochondrial dysfunction to overcome BRAF inhibitor resistance in advanced melanoma: the role of disulfiram as a copper ionophore“的研究成果，该成果分析揭示DSF通过诱导线粒体氧化损伤克服耐药性的全新机制——TXNIP与TRX2互作。DSF与BRAF抑制剂（BRAFi）联用是一种极具潜力的联合疗法，有望快速进入临床研究，改善晚期黑色素瘤患者的预后。文章中所用蛋白质组学服务由诺禾致源提供。

研究思路

1. 创新视角，跳出传统的MAPK通路再激活框架，将目光投向肿瘤细胞的代谢弱点——线粒体：利用已上市药物双硫仑（Disulfiram, DSF）的铜离子载体特性，促使铜离子在细胞内蓄积，进而特异性破坏BRAF抑制剂（BRAFi）耐药黑色素瘤细胞的线粒体功能，最终逆转其耐药状态。

2. 转录组学的发现与蛋白质组学的互作验证强强联合，构建完整的证据链：转录组锁定潜在关键基因TXNIP（Thioredoxin-interacting protein），蛋白质组无偏、全面分析并筛选出TXNIP互作蛋白硫氧还蛋白2（Thioredoxin 2，TRX2）。多组学联合分析DSF与BRAFi联合作用核心——TXNIP与TRX2相互作用。

3. 体外/体内模型功能验证，证实DSF作用原理与潜在治疗价值：DSF与BRAFi联用是一种极具潜力的、可快速进入临床研究的老药新用策略，用于治疗耐药性晚期黑色素瘤，且药效依赖于TXNIP-TRX2。文章中所用蛋白质组学服务由诺禾致源提供。

研究流程图

关键结果

1.DSF通过铜依赖途径协同BRAFi杀伤耐药黑色素瘤细胞

图1 DSF以铜依赖的方式抑制BRAFi耐药黑色素瘤的生长

(A) Vem和DSF单药及联用（48小时）对BRAFi耐药黑色素瘤细胞活力的影响（CCK-8法）；(B) Vem单独治疗、DSF单独治疗或Vem+DSF联合治疗的小鼠肿瘤的图像，肿瘤体积和重量；(C) 20μM TTM预处理对Vem+DSF联合药效的影响（CCK-8评估细胞活力）；(D) 20μM TTM预处理对Vem+DSF联合疗法抗肿瘤效果的影响，肿瘤代表性图片、肿瘤体积及重量

通过体外细胞实验表明BRAF抑制剂BRAFi（Vemurafenib，Vem）与DSF联合用药可显著降低耐药黑色素瘤细胞系（451Lu-R和UACC62-R）的存活率，且对肿瘤生长抑制的效果显著由于单独使用Vem或DSF（图1A）。同时，动物模型实验结果也表明Vem+DSF联用，在体内也能显著抑制耐药肿瘤的生长，进一步验证体外的协同效应（图1B）。

为了进一步探究Vem+DSF联用调控细胞死亡的形式，研究人员使用了多种抑制剂对细胞进行预处理。结果表明，铜螯合剂TTM预处理细胞完全逆转了Vem+DSF的“杀伤”效果，耐药黑色素瘤细胞存活率恢复到接近对照组水平（图1C）。随后的体内实验再次证实，DSF的增效作用依赖于铜离子，“剥夺”铜离子可以逆转DSF的疗效（图1D）。

2.DSF诱导黑色素瘤细胞线粒体结构与功能的障碍

图2 DSF通过诱导线粒体功能障碍来逆转对黑色素瘤细胞对BRAFi的抵抗作用

(A) RNA-seq基因富集分析（Vem单独处理，Vem+DSF联合处理）；(B) Vem单独处理或Vem+DSF联合处理线粒体形态图（BRAFi细胞系：451Lu-R和UACC62-R）；(C) JC-1染色法测定Vem单独处理或Vem+DSF联合处理（BRAFi细胞系：451Lu-R和UACC62-R）线粒体膜电位；(D) Vem单独处理或Vem+DSF联合处理（BRAFi细胞系：451Lu-R和UACC62-R）ATP含量；(E) Seahorse分析Vem单独处理或Vem+DSF联合处理（BRAFi细胞系：451Lu-R和UACC62-R）细胞的耗氧率（OCR）

为深入探究Vem与DSF联合诱导耐药黑色素瘤细胞死亡的机制，我们对经Vem单药及Vem与DSF联合处理的BRAFi耐药细胞进行了转录组测序，并比较其转录谱差异。GO分析显示，差异表达基因显著富集于线粒体结构与功能相关通路（图2A）。透射电镜结果（图2B）及JC-1染色结果（图2C）进一步表明，DSF可显著破坏线粒体超微结构并降低线粒体膜电位。此外，ATP含量检测（图2D）及Seahorse线粒体呼吸测定结果（图2E）一致显示，DSF处理能明显损害线粒体功能，尤其表现为线粒体耗氧率（Oxygen consumption rate，OCR）的下降，提示DSF特异性抑制氧化磷酸化过程。

综上所述，DSF逆转BRAFi耐药的核心机制可能与其诱导线粒体结构与功能严重损伤密切相关，尤其是通过特异性抑制氧化磷酸化，从而阻断了耐药细胞的能量代谢供应。

3.线粒体功能障碍由氧化应激介导

图3 DSF引起的线粒体功能障碍依赖于氧化应激的加剧

(A) 检测BRAFi耐药细胞经Vem或Vem+DSF处理后线粒体活性氧（mt-ROS）水平。（左：流式细胞术，右：免疫荧光染色）； (B) Mito-TEMPO预处理BRAFi细胞后，Vem或Vem+DSF对细胞活力的水平（左：CCK-8，右：克隆形成）；(C) Mito-TEMPO预处理BRAFi细胞后，Vem或Vem+DSF对线粒体形态的影响；(D) Mito-TEMPO预处理BRAFi细胞后，Vem或Vem+DSF对线粒体膜电位（MMP荧光染色）的影响；(E) Mito-TEMPO预处理BRAFi细胞后，Vem或Vem+DSF对ATP水平的影响；(F) Seahorse分析Mito-TEMPO预处理BRAFi细胞后，Vem或Vem+DSF对细胞的耗氧率（OCR）的影响

近期研究表明，细胞内铜浓度上升会加剧活性氧的生成，从而导致线粒体功能紊乱。那么，当使用DSF处理耐药细胞时，氧化应激是否在其中发挥作用？

实验发现，DSF处理促使耐药细胞线粒体内的活性氧（mt-ROS）水平显著上升（图3A）。为进一步验证氧化应激的作用，研究者使用Mito-TEMPO——一种能够特异性清除线粒体内超氧化物的抗氧化剂，对细胞进行处理。

结果显示，Mito-TEMPO有效清除了mt-ROS（图3B-F）。在后续功能实验中，CCK-8与克隆形成试验一致表明：清除mt-ROS明显缓解了“Vem+DSF”对细胞生长的抑制（图3B）。透射电镜观察（图3C）、线粒体膜电位测定（图3D）、Seahorse能量代谢分析（图3E）及ATP含量（图3F）检测也进一步证实，Mito-TEMPO预处理可显著恢复由DSF引发的线粒体功能损伤。

综上，这些数据说明，DSF主要通过诱发氧化应激、破坏线粒体功能，进而抑制耐药黑色素瘤细胞的生长。

4.铜离子是氧化损伤的“始作俑者”

图4 清除铜离子可逆转DSF诱发的线粒体氧化损伤

(A) 采用流式细胞术(左)和免疫荧光染色（右）检测BRAFi细胞在经20μM TTM预处理（或不预处理），随后经Vem或Vem+DSF处理后的线粒体活性氧（mt-ROS）水平； (B) 透射电镜观测BRAFi细胞在经20μM TTM预处理（或不预处理），随后经Vem或Vem+DSF处理后的线粒体形态；(C)免疫荧光染色检测BRAFi细胞在经20μM TTM预处理（或不预处理），随后经Vem或Vem+DSF处理后的线粒体膜电位（MMP）水平； (D) 经Seahorse分析BRAFi细胞在TTM预处理（或不预处理），随后经Vem或Vem+DSF处理后线粒体的呼吸功能；(E) BRAFi细胞在TTM预处理（或不预处理），随后经Vem或Vem+DSF处理后的ATP水平；(F) BRAFi细胞在TTM预处理（或不预处理），随后经Vem或Vem+DSF处理后细胞的活力；(G) 采用CCK-8法检测FDX1敲低的BRAFi细胞在Vem或Vem+DSF处理下的细胞活力；(H) 采用CCK-8法检测FDX1过表达的BRAFi细胞在Vem或Vem+DSF处理下的细胞活力

既往研究表明，DSF可介导铜离子内流。为探究铜离子在DSF诱导的线粒体氧化损伤中的作用，本研究采用TTM预处理去除培养体系中的铜离子，并系统评估其对线粒体结构与功能的影响。流式细胞术与共聚焦显微镜结果显示（图4A），TTM处理显著降低了DSF在BRAFi耐药黑色素瘤细胞中引发的线粒体氧化应激水平。透射电镜图进一步显示，TTM预处理可维持Vem+DSF处理组中线粒体的正常形态，经联合处理的BRAFi细胞未出现肿胀、空泡化及嵴结构丢失等病理改变（图4B）。JC-1染色结果表明，TTM预处理有效阻止了Vem+DSF所引起的线粒体膜电位崩溃（图4C），并缓解氧化呼吸功能损伤（图4D和E）。克隆形成实验也证实，TTM可逆转Vem+DSF对BRAFi耐药细胞生长的抑制（图4F）。上述结果表明，清除铜离子可逆转DSF所诱发的线粒体氧化应激，从而恢复其结构与功能。

基于FDX1在铜死亡通路中的关键作用，我们在耐药细胞中对FDX1进行表达调控。值得注意的是，敲低FDX1并未减弱Vem+DSF的协同抑制作用（图4G），而过表达FDX1也未进一步增强该联合处理的疗效（图4H），提示Vem+DSF的抗肿瘤效应可能独立于经典的FDX1介导的铜死亡通路。

5.TXNIP-TRX2互作是介导氧化损伤的核心分子机制

图5 TXNIP通过TRX2结合进而影响线粒体活性氧mt-ROS的积累和细胞死亡

(A) 通过转录组分析Vem单独处理或Vem+DSF联合处理的BRAFi细胞的差异基因；(B) 通过WB分析Vem单独处理或Vem+DSF联合处理的BRAFi细胞中TXNIP的表达情况；(C) 在对裸鼠进行为期14天的 Vem+DSF或Vem治疗后，接种对照细胞（451Lu-R ko-NC）或TXNIP敲除细胞（451Lu-R ko-TXNIP）的裸鼠体内剥离的肿瘤实物图、肿瘤体积和肿瘤重量；(D) 通过STRING数据库构建TXNIP互作网络；(E) 互作蛋白表达差异火山图；(F) 采用流式细胞术检测BRAFi细胞在经TXNIP-in-1预处理（或不预处理），随后经Vem或Vem+DSF处理后的线粒体活性氧（mt-ROS）水平；(G) 采用CCK-8法检测TRX2敲低的BRAFi细胞在不同处理条件下的细胞活力

为深入探究DSF与Vem联合治疗的分子机制，研究人员对Vem单药及Vem+DSF联合处理的细胞进行了转录组测序分析。结果显示，TXNIP（Thioredoxin Interacting Protein）是表达上调最显著的基因之一，且其表达与DSF处理高度相关，因此被确定为后续研究的焦点（图5A）。Western blotting结果进一步证实，Vem+DSF组细胞中TXNIP蛋白水平显著高于Vem单药组，而该上调效应可被铜螯合剂TTM完全阻断（图5B），表明DSF诱导的TXNIP表达依赖于铜离子。动物实验也一致表明，TXNIP是DSF发挥抗肿瘤作用的核心分子。如图5C所示，在接种TXNIP敲除的BRAFi耐药细胞的小鼠中，Vem+DSF联合治疗的抑瘤效果显著减弱，表现为ko-TXNIP组肿瘤体积和重量均明显大于对照组（ko-NC），说明TXNIP缺失几乎完全消除了联合治疗的疗效。以上体内外实验共同证实，TXNIP是介导Vem+DSF协同抗肿瘤作用的关键因子。

随后，通过STRING数据库对TXNIP的互作网络进行分析，预测其与硫氧还蛋白（Thioredoxin，TXN/TRX）家族成员（如TRX1、TRX2）存在强烈相互作用（图5D）。为进一步明确TXNIP的结合蛋白，研究人员对TXNIP免疫共沉淀产物进行蛋白质谱分析，发现在Vem+DSF刺激下，TRX1与TRX2的确与TXNIP发生显著结合（图5E）。采用TXNIP与TRX互作抑制剂TXNIP-IN-1进行验证，发现其预处理可完全抑制Vem+DSF引发的线粒体活性氧（mt-ROS）爆发，表明TXNIP正是通过结合TRX蛋白触发氧化应激（图5F）。进一步利用siRNA分别敲低TXN1和TXN2，发现仅敲低TRX2可显著逆转Vem+DSF的细胞杀伤作用（图5G），说明TXNIP特异性通过抑制线粒体TRX2的抗氧化功能，导致耐药黑色素瘤细胞中mt-ROS的积累。

综上所述，通过整合转录组学、蛋白质组学及互作抑制实验，本研究系统阐明了DSF/Cu²?通过上调TXNIP，使其进入线粒体与TRX2结合并抑制其功能，从而解除对mt-ROS的抑制，最终诱发氧化应激及细胞死亡的分子机制。

文章总结

总结模型：DSF通过铜离子载体作用，诱导TXNIP上调，并与TRX2相互作用，导致线粒体氧化应激和功能障碍，从而杀死BRAFi耐药的黑色素瘤细胞。

创新性与意义：

(1) 老药新用：为安全性高的老药DSF找到了克服肿瘤耐药的全新应用场景。

(2) 机制新颖：首次揭示TXNIP-TRX2互作在DSF诱导的线粒体氧化损伤中的核心作用，是一种非凋亡、非经典铜死亡（不依赖FDX1）的新机制。

(3) 策略创新：提供了独立于MAPK通路的克服耐药新策略，具有重要的理论和临床意义。

(4) 临床展望：体内/体外实验均强烈提示DSF与BRAFi联用是一种极具潜力的联合疗法，有望快速进入临床研究，改善晚期黑色素瘤患者的预后。