HPD（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，4-羟基苯丙酮酸双加氧酶）是酪氨酸分解代谢途径中的关键酶，既往研究显示HPD在乳腺癌、肺癌和肝癌中表达和功能异常。此外，HPD的同源蛋白——HPDL（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase-like protein, 4-羟基苯丙酮酸双加氧酶样蛋白）是一种潜在的RBP（RNA-binding Protein, RNA结合蛋白）。那么，HPD是否具有RBP的功能并参与调节肿瘤发展呢？

2025年6月，来自南开大学的山长亮、天津中医药大学张帅老师团队在顶级期刊Advanced Science（IF=15.6）发表题为“HPD is an RNA-Binding Protein Sustaining Ovarian Cancer Cell Glycolysis, Tumor Growth, and Drug Resistance”的研究成果，该成果首次揭示代谢酶HPD作为非经典RBP通过影响卵巢癌中mRNA的翻译效率，进而促进糖酵解通量、肿瘤生长和化疗耐药。其中蛋白质组技术解析蛋白质互作网络，为HPD的互作机制解析提供了强大的支持。本研究为HPD调节肿瘤发展和耐药提供了新思路。文章中所用蛋白质组学服务由诺禾致源提供。

研究思路

1.多组学筛查，锁定HPD的RNA结合新身份：首先利用RIP-seq等技术进行“全局搜索”，首次鉴定出HPD是一个全新的非经典RBP（RNA-binding Protein, RNA结合蛋白）。

2.蛋白质谱助力揭示的翻译新机制：通过蛋白质谱技术分析HPD互作网络，进而发现HPD能特异性“招募”核糖体蛋白（如RPS10），促进mRNA的翻译效率，尤其显著提升糖酵解酶TPI和ENO1的蛋白合成。该功能依赖其RBDs（dsRNA binding domains, 双链RNA结合域），且独立于其传统的代谢酶活性。

3.体内外模型+临床样本，证实其促癌价值与治疗潜力：抑制HPD的RNA结合功能，能有效阻断糖酵解、抑制肿瘤生长，并增强卵巢癌对化疗药物紫杉醇的敏感性。特异性靶向HPD-RBP功能域的小分子抑制剂（NTBC）有望成为下一代抗癌药物研发的重要突破口，为临床治疗提供更精准的“分子手术刀。文章中所用蛋白质组学服务由诺禾致源提供。

研究流程图

关键结果
1.代谢酶HPD的全新角色——RNA结合蛋白。

图1 HPD是一种新的非经典RBP，可与多种mRNA结合

(A) A2780细胞系中oligo (dt)特异性富集mRNA定量PCR和western blot分析；(B) OVCAR3细胞系中oligo (dt)特异性富集mRNA定量PCR和western blot分析；(C) 基于RIP-seq分析HPD与mRNA的结合区域

研究人员通过Oligo (dT) pull-down技术在人卵巢癌细胞系（A2780和OVCAR3）中全面证明HPD是一种非经典RBP，并且具有与mRNA结合的能力（图1A和B）。进一步分析RIP-seq (RNA-immunoprecipitation sequencing)结果发现，HPD主要与mRNA的CDS区结合（图1C）。说明HPD具有RNA结合能力，是一种新的、非典型的RBP。

2.HPD促进全局mRNA翻译。

图2 HPD促进于全局mRNA翻译

(A)检测HPD敲低或外源表达对全局翻译效率的影响（A2780细胞系）；(B) 多聚核糖体法检测HPD敲除对翻译的影响（A2780细胞系）；(C) Ribo-seq分析受HPD调控的多核糖体相关mRNA； (D) KEGG分析翻译水平的下调基因（Ribo-seq）；(E) HPD敲低细胞系中糖酵解酶的表达水平；(F) HPD敲低细胞系中TPI和ENO1的转录水平分析；(G) HPD敲低细胞系中TPI和ENO1的mRNA稳定性分析；(H) HPD敲低细胞系中TPI和ENO1的蛋白稳定性分析；

为了确定HPD对mRNA的调节作用，我们在HPD敲低细胞和对照细胞（A2780细胞系）之间进行了各项实验。结果表明，全局翻译效率随着HPD的过表达而增加，随着HPD的敲低而降低（图2A和B）。进一步的Ribo-seq检测分析正在发生翻译的mRNA信息，发现敲除HPD导致1640个mRNA的翻译效率降低，包括糖酵解相关mRNA（如ENO1和TPI1）（图2C）。KEGG分析发现HPD敲除影响糖酵解途径（图2J）。这些结果表明，HPD作为一种非典型RBP可显著提高翻译效率，同时影响着与肿瘤发生发展息息相关的糖酵解途径。

考虑到糖酵解与肿瘤的发生发展息息相关，且先前研究结果提示HPD会显著影响糖酵解相关途径和关键酶——ENO1和TPI（图2D）。研究人员重点关注了HPD对ENO1和TPI的翻译调节作用。结果显示，HPD敲低后TPI和ENO1的蛋白水平降低（图4E），然而TPI和ENO1的mRNA水平不受HPD的影响（图4F）。此外，TPI和ENO1的mRNA稳定性不受HPD调节（图4G），敲低HPD对TPI和ENO1的蛋白质稳定性没有显着影响（图4H）。这些结果验证了HPD控制着ENO1和TPI的翻译调节。

3.RBD结构域是HPD与mRNA结合的关键区域。

图3 RBD结构域是与mRNA结合的关键

(A) 体外RNA Pull-down分析HPD、HPD缺失突变体（ΔRBD1/2）与mRNA的结合能力分析；(B) 体内CLIP-qPCR分析HPD、HPD缺失RBD突变体（ΔRBD1/2）与mRNA的结合能力分析；(C) Oligo(dT) Pull-down WB 分析HPD、HPD缺失RBD突变体（ΔRBD1/2）与mRNA的结合能力分析；(D) HPD、HPD缺失突变体（ΔRBD1/2）和HPB无代谢酶的突变体的mRNA翻译效率分析；(E) GO分析蛋白质谱鉴定的HPD互作蛋白；(F) Pull-down验证HPD与RPS10的互作关系

为进一步探究HPD的哪个结构域负责与mRNA的结合，研究人员通过体外（in vitro）和体内（in vivo）实验，证明RBD结构域对HPD的RNA结合能力至关重要（图3A-C），破坏RBD结构域会显著抑制HPD与mRNA的结合能力。

HPD本身具有代谢酶的功能，为了进一步分析HPD促进mRNA翻译的能力是否与其代谢酶活性相关，研究人员构建了相应的酶失活突变体（HPD-H183A）。结果显示，HPD中的RBDs结构域被特异性删除时，HPD对全局mRNA翻译的促进功能消失，而RBD代谢酶失活的突变体依旧具有mRNA翻译促进功能。这表明HPD促进翻译的功能与其代谢酶活性无关（图3D）。

为了进一步证实HPD在促进翻译中的作用以及能否与翻译因子结合（translational factors），研究人员利用Co-IP（co-immunoprecipitation）和蛋白质组学技术对HPD的互作关系网进行了分析。数据显示，一些与翻译功能密切相关的核糖体蛋白，如RPS10、RPL10、RPL20可能与HPD相互作用（图3E）。随后的体外验证实验也表明RPS10确实能与HPD结合（图3F）。综上所述，这些结果表明HPD依靠其RBD结构域结合mRNA，并招募核糖体蛋白来促进翻译效率，并且该功能与其酪氨酸分解代谢活性无关。

4.HPD依赖其RBP功能驱动糖酵解和肿瘤生长。

图4 RBP结构域对肿瘤生长和糖酵解具有重要作用

(A) HPD敲低裸鼠模型肿瘤生长情况、肿瘤体积和肿瘤重量；(B) HPD敲低肿瘤组织中TPI和ENO1的蛋白水平分析；(C) HPD缺失细胞系回补野生型HPD（HPD-WT）后ENO1和TPI蛋白表达水平，葡萄糖消耗和乳酸水平，以及细胞增殖能力分析；(D) HPD缺失细胞系回补RBP结构域缺失HPD（ΔRBD1/2）后ENO1和TPI蛋白表达水平，葡萄糖消耗和乳酸水平，以及细胞增殖能力分析

为了进一步探究ENO1和TPI是否以HPD介导方式参与人卵巢癌的发生发展，研究人员展开了进一步的实验。如图4A所示，敲低HPD可显著抑制肿瘤在小鼠体内的生长（图4A）。分析肿瘤组织中ENO1和TPI的表达情况发现，HPD敲低肿瘤组织中TPI和ENO1的蛋白水平显着降低（图4B）。以上结果表明HPD介导的ENO1和TPI对卵巢癌的发生发展至关重要。

为进一步证实RBP结构在糖酵解过程中也具有不可替代的作用，在HPD缺失的细胞系中展开了回补实验。回补野生型HPD（HPD-WT）能够逆转因内源HPD缺失造成的表型（葡萄糖吸收，乳酸产生和细胞增殖）（图4C）。而回补RBP结构域缺失的突变体（ΔRBD1/2）则无法恢复相应的功能（图4D）。以上结果表明HPD以RBP依赖性方式促进糖酵解和细胞增殖。

5.靶向HPD-RNA互作可增强化疗敏感性。

图5 靶向HPD的RNA结合功能可有效增强卵巢癌对标准化疗药紫杉醇（Taxol）的敏感性

(A) RNA Pull-down实验分析NTBC处理前后HPD与mRNA（TPI/ENO1）的结合能力；(B) CLIP-qPCR实验分析NTBC处理前后HPD与mRNA（TPI/ENO1）的结合能力； (C) 不同NTBC处理前后的卵巢癌细胞的整体翻译效率分析；(D) 不同浓度NTBC处理卵巢癌细胞的糖酵解相关酶的蛋白表达水平分析；(E) NTBC处理前后异种移植裸鼠中肿瘤生长曲线；(F) NTBC、紫杉醇Taxol单独处理或联合处理前后异种移植裸鼠中肿瘤生长曲线；(G) IHC检测异种移植裸鼠肿瘤中Ki67的表达水平

许多文献报道NTBC是HPD的抑制剂，该研究就NTBC是否在卵巢癌中能否发挥作用也展开了相关研究。体外与体内实验均发现NTBC处理显著降低了HPD与mRNA（TPI和ENO1）的结合能力（图5A和B）。这说明NTBC是HPD-RNA相互作用的有效抑制剂。后续的实验也发现NTBC处理卵巢癌细胞后，翻译效率显著降低（图5C），且NTBC处理以浓度依赖性的方式下调了关键糖酵解酶TPI和ENO1的蛋白水平（图5D）。

进一步的体内研究发现，NTBC单药治疗即可显著抑制异种移植裸鼠模型中肿瘤的生长（图5E），与紫杉醇（Taxol，一种临床常用的卵巢癌治疗药物）联用展现出协同效应（图5F）。利用IHC对卵巢样本进行Ki67免疫组化分析，结果显示NTBC和紫杉醇的组合对卵巢癌的生长具有更好的抑制作用（图5G）。基于上述结果，小分子抑制剂可靶向阻断HPD与mRNA的结合，抑制卵巢癌的发展，并增强紫杉醇反应，为临床用药提供了新的理论依据。

文章总结

HPD通过其RBD结构域直接结合mRNA的CDS区域，通过蛋白质组学构建HPD互作网络，发现HPD通过招募翻译因子，进而显著提升mRNA的翻译效率，特别是糖酵解代谢酶TPI和ENO1的mRNA的翻译，从而促进卵巢癌糖酵解途径并驱动肿瘤发展。阻断RBD的功能域可破坏HPD结合RNA的功能，进而抑制全局mRNA翻译并阻碍癌症发展。同时，研究还发现阻断HPD与mRNA的结合，还会增强化疗药物紫杉醇的疗效。这项研究不仅刷新了酪氨酸代谢酶HPD的经典理论框架，还为卵巢癌的精准治疗提供了新思路。