近日，同济大学医学院程黎明教授、同济大学生命科学与技术学院高绍荣教授、朱融融教授团队，在Signal Transduction and Targeted Therapy 杂志在线发表题为“F-box/LRR-repeat protein 12 reorchestrated microglia to inhibit scarring and achieve adult spinal cord injury repair”的研究论文。

该研究利用空间转录组、表观组学、bulk RNA-seq等对脊髓损伤病理进程进行了长时程多组学联合解析，首次揭示了脊髓病理进程的关键调控因子Fbxl12，并阐明了其作为脊髓损伤后无瘢痕修复新靶点的分子作用机制，进而围绕Fbxl12建立了全新脊髓损伤无瘢痕修复干预策略。其中诺禾致源提供了本研究空间转录组技术服务。

研究背景

脊髓损伤（SCI）是影响神经系统的严重疾病，大部分患者将面临终身残疾，SCI常伴随病理性瘢痕形成，阻止受损轴突跨损伤区再生进而影响神经功能恢复，小胶质细胞在神经系统内起到关键的免疫监视作用，其活动和状态会影响损伤后的修复过程。

研究结果

1.SCI的病理进程中，FBXL12的m6A甲基化可能是关键调控因子

本研究通过小鼠模型系统性研究了SCI的转录后修饰谱及潜在调控因子。在损伤后，m6A成为主要修饰类型，其修饰位点显著改变。关键m6A修饰酶如Mettl3、Mettl14等呈现时间依赖性改变，暗示m6A在SCI的病理进程中发挥重要作用。通过整合转录组和m6A修饰数据，研究发现Fbxl12与SCI相关，其mRNA表达水平和m6A修饰显著升高。

图1 Fbxl12的m6A甲基化是脊髓损伤（SCI）进展过程中的可能关键调控因子

2.m6A促进活化小胶质细胞中FBXL12的合成

免疫组化显示，损伤后小胶质细胞的Fbxl12上调，表明m6A促进小胶质细胞中FBXL12的合成。为探究损伤是否刺激小胶质细胞中Fbxl12的改变，体外实验发现，髓鞘碱性蛋白（MBP）刺激显著增加了Fbxl12 mRNA的m6A修饰和FBXL12蛋白水平，而脂多糖（LPS）无此作用，提示m6A甲基化促进FBXL12蛋白的翻译。

为验证m6A甲基化是否参与FBXL12的翻译调控，对活化小胶质细胞中FBXL12的调控分析表明m6A书写器Mettl3和阅读器YTHDF1的敲低可抑制FBXL12翻译。进一步实验验证了敲除Mettl3显著下调小胶质细胞中的Fbxl12表达，确认了m6A对Fbxl12表达的调控作用。

图2 m6A促进小胶质细胞中FBXL12的合成

3.FBXL12调控细胞骨架重组、促进小胶质细胞迁移并调节其免疫响应

本研究继续通过靶向调控和敲除FBXL12表达来研究其体外功能。靶向FBXL12增强了小胶质细胞的运动性，而敲除则降低其运动性。过表达的FBXL12使小胶质细胞呈立体形态，丝状伪足增多。RNA测序表明Fbxl12调控包括细胞迁移、免疫响应及瘢痕形成等相关途径。

图3 FBXL12调控小胶质细胞的细胞骨架重组、促进其迁移并调节免疫反应

4.靶向干预FBXL12上调可促进脊髓损伤后小胶质细胞的迁移

通过病毒载体AAV-FBXL12注射提升小胶质细胞的分散分布，为进一步阐明靶向过表达Fbxl12促进损伤修复的机制，对损伤后14天的小鼠脊髓进行10x Visium空间转录组测序。降维聚类分析显示，与SCI组相比，AAV-Fbxl12注射组的神经元比例显著增加。分别以Snap25、Cx3cr1和Lum作为神经元、小胶质细胞与成纤维细胞的标志物，展示其UMAP分布与空间定位，后续GO分析表明，AAV-Fbxl12注射组在迁移正向调控（涉及Fgr、Mmp2、Itga5、Gpnmb、Sema4g和Cd274等基因）方面评分显著更高，且该过程主要受小胶质细胞调控。为确认Fbxl12上调后小胶质细胞的分子特征，本研究检测了脊髓中脂肪酸结合蛋白5（FABP5）和干扰素诱导跨膜蛋白3（IFITM3）的表达。单细胞RNA测序研究显示，FABP5特异性表达于胚胎期小胶质细胞，而IFITM3在衰老及神经退行性疾病的小胶质细胞中显著上调。损伤后28天的脊髓切片免疫荧光显示，AAV-FBXL12递送显著改变了FABP5表达，并抑制损伤中心周围小胶质细胞的IFITM3表达。此外，与SCI组相比，FBXL12上调的小胶质细胞表现出前人研究报道的无瘢痕愈合特性（Ms4a7、Thbs1、Ms4a6c和Lgals1等基因特征）总之，以上结果显示了FBXL12上调可通过增强小胶质细胞运动性，赋予其特定伤口愈合特征，并减少IFITM3依赖的衰老样分子表型。

图4 AAV-Fbxl12递送促进脊髓损伤（SCI）后小胶质细胞的迁移

5.AAV-FBXL12治疗可抑制损伤后瘢痕形成并促进功能恢复

AAV-FBXL12治疗后，由特定标记物界定的瘢痕区域显著减小。瘢痕是抑制轴突再生的关键空间屏障，研究由此探究FBXL12诱导的无瘢痕修复能否促进轴突再生。令人振奋的是，AAV-FBXL12治疗后有更多5-HT能轴突穿越损伤中心，出现再生轴突生长，为评估损伤后免疫环境，研究还检测了炎症反应和星形胶质细胞表型。数据显示AAV-Fbxl12注射后促炎基因iNOS显著下调，星形胶质细胞趋于稳态表型，进一步通过电生理检测评估发现AAV-FBXL12治疗后的神经传导功能出现明显恢复，补体-凝血级联通路空间定位显示，AAV-FBXL12治疗后损伤区补体分泌显著减少，该现象与体外小胶质细胞过表达Fbxl12的RNA-Seq结果高度一致，这些结果提示，AAV-Fbxl12注射通过增强小胶质细胞运动性，减少对外周单核细胞的趋化作用，调控免疫微环境并减轻补体通路损伤，最终促进神经细胞再生与脊髓功能重建。

图5 向小胶质细胞鞘内递送FBXL12可减少瘢痕形成、改善病理状况并促进小鼠轴突再生

6.FBXL12通过介导MYH14的K63泛素化协调小胶质细胞骨架重组

液相色谱-串联质谱分析显示活化小胶质细胞中的FBPs显著改变，尤其是肌球蛋白复合物。FBXL12敲除降低了MYH14的K63泛素化水平，表明FBXL12正向调控MYH14表达。MYH14的敲低有效阻断了FBXL12过表达引起的迁移增强，证实了FBXL12在小胶质细胞中细胞迁移的调控作用。

图6 FBXL12介导MYH14的K63泛素化以协调小胶质细胞的细胞骨架重组

总结

该研究通过详尽的实验验证了FBXL12在调节小胶质细胞活性以促进神经功能恢复的作用。通过改变小胶质细胞的行为明显抑制不利瘢痕形成，从而改善脊髓损伤后的治疗效果。这个发现为今后利用特异性蛋白质调节小胶质细胞状态，作为神经损伤治疗策略提供了新的研究路径。