骨骼稳态依赖于骨形成与骨吸收的动态平衡。近年来，骨免疫学研究揭示了免疫系统与骨骼的密切相互作用。巨噬细胞作为天然免疫的核心细胞，在骨微环境中表现出显著可塑性：既能分化为执行骨吸收的破骨细胞，又能通过分泌因子调控成骨和血管生成过程。然而，决定巨噬细胞分化命运的关键分子机制尚不明确。RKIP（Raf kinase inhibitor protein）作为多功能信号调节蛋白，已知参与Raf/MEK/ERK、NF-κB等重要通路，在细胞分化和免疫调节中发挥作用，但其在骨稳态及巨噬细胞命运决定中的具体功能仍有待探索。

2025年8月，来自浙江大学附属邵逸夫医院的赵凤东老师团队在顶级期刊Nature Communications（IF=16.6）发表题为“RKIP regulates bone marrow macrophage differentiation to mediate osteoclastogenesis and H-type vessel formation“的研究成果，该成果本研究首次揭示了RKIP通过调控巨噬细胞的分化命运，双向影响骨吸收与骨形成，从而维持骨稳态。为治疗骨质疏松等骨代谢疾病提供了新的潜在靶点。文章中所用蛋白质组学服务由诺禾致源提供。

研究思路

1.从正向表型出发，确立核心科学问题：RKIP全身性敲除小鼠表现出显著的骨量增加。通过Micro-CT、组织形态计量学及血清骨代谢标志物（CTX-1, PINP）分析，确认该表型源于骨吸收的抑制与骨形成的促进。并由此，研究确立了核心科学问题：RKIP通过何种细胞类型与分子机制，双向调控骨骼的分解与合成代谢。

2.通过细胞特异性功能缺失模型，精准定位核心作用细胞：通过构建系列条件敲除小鼠，以精确解析RKIP在不同细胞系中的功能。进而明确RKIP对骨稳态的调控作用，核心在于其在巨噬细胞（破骨细胞前体）中的功能。

3.IP-MS联合多组学技术，系统解析胞质与核内的双重调控机制：通过蛋白质谱技术绘制了RKIP的相互作用网络，进而揭示了其在胞内的作用机制；并联合单细胞分析等技术，阐明了RKIP在细胞核内的独特功能。该研究从系统层面到分子细节，揭示了RKIP功能因其细胞定位不同而存在差异，这种“双重功能”为理解骨稳态的精密调控提供了全新的理论框架。文章中所用蛋白质组学服务由诺禾致源提供。

研究流程图

关键结果

1.RKIP全局敲除(gKO)导致骨量显著增加

图1 全身性敲除RKIP可抑制骨吸收并促进骨形成

(A) 通过Micro-CT分析股骨远端骨微结构；(B) 通过H&E染色和TRAP染色评估骨组织形态和破骨细胞数量；(C) 通过钙黄绿素双标染色检测动态骨形成，通过Von Kossa染色观察矿化基质；(D) 通过免疫荧光染色检测OCN阳性成骨细。

为探究RKIP在骨稳态中的生理功能，研究团队构建了RKIP全身性敲除（gKO）小鼠模型。通过与其同窝野生型对照进行比较，发现RKIP缺失能显著改变骨骼表型。

微观结构分析显示，gKO小鼠的股骨远端呈现出更高的骨小梁骨量和更厚的皮质骨（图1A）。组织学证据进一步表明，其骨吸收活动受到抑制，TRAP染色显示破骨细胞数量与活性显著降低（图1B）。与此同时，骨形成过程则被增强：钙黄绿素双染色显示矿物沉积速率加快，Von Kossa染色证实矿化骨基质增多（图1C）；免疫荧光染色也观察到成骨细胞标志物骨钙素（OCN）的阳性细胞数增加（图1D）。

综上，RKIP的缺失通过协同抑制骨吸收与促进骨形成，在体内导致骨硬，确立了RKIP作为骨稳态关键调控分子的角色。

2.巨噬细胞特异性RKIP敲除（cKO）重现高骨量表型并抑制破骨生成

图2 在巨噬细胞中对RKIP进行条件性敲除会阻碍破骨细胞生成

(A) 通过H&E染色检测成骨细胞谱系条件性敲除小鼠（Prx1-Cre、Osx-Cre、OCN-Cre）的骨骼结构；(B) 通过Western blot检测破骨细胞分化过程中RKIP的表达动态；(C) 通过免疫荧光染色检测OVX模型中RKIP与ACP5的共定位情况；(D) 通过Micro-CT分析cKO小鼠的骨微结构变化；(E) 通过H&E和TRAP染色检测cKO小鼠的骨密度和破骨细胞数量；(F) 通过TRAP和F-actin染色检测cKO来源BMMs的破骨细胞分化能力；(G) 通过扫描电镜检测cKO来源破骨细胞的骨吸收功能；(H) 通过Western blot检测cKO组破骨细胞关键因子的蛋白表达。

为明确RKIP调控骨形成的细胞机制，研究人员通过条件性基因敲除技术，在成骨细胞分化各阶段特异性敲除RKIP，发现小鼠骨骼微结构均无显著改变（图2A），表明RKIP不直接调控成骨细胞功能。

研究随后聚焦破骨细胞，发现RANKL诱导的破骨分化过程中RKIP表达逐步上调（图2B），且在卵巢切除OVX模型中破骨细胞内RKIP表达显著升高，提示其参与骨吸收调控。为进一步确认RKIP的功能，构建巨噬细胞特异性RKIP敲除（cKO）小鼠并进行进一步分析。Micro-CT结果显示cKO小鼠骨小梁质量与皮质骨厚度均显著增加（图2D），证实巨噬细胞是RKIP调控骨稳态的核心细胞。组织学分析显示cKO小鼠破骨细胞数量显著减少（图2E）。体外实验表明cKO来源的骨髓巨噬细胞破骨分化能力受损，F-actin环结构形成缺陷（图2F），骨吸收陷窝面积减小（图2G），破骨细胞关键转录因子c-Fos与NFATc1表达下降（图2H）。

这些结果表明RKIP是破骨细胞分化与功能所必需的，其在巨噬细胞中的缺失通过抑制骨吸收导致骨量增加。

3.RKIP通过与ARHGAP相互作用来促进破骨细胞的生成

图3 RKIP通过竞争性结合ARHGAP来抑制CDC42失活，从而促进破骨细胞生成

(A) 通过GO富集分析检测差异表达基因的功能通路；(B) 通过Co-IP联合质谱分析筛选RKIP相互作用蛋白；(C) 通过Western blot检测CDC42活化情况；(D) 通过免疫荧光染色检测RKIP与CDC42的共定位情况；(E) 通过Co-IP检测RKIP过表达时ARHGAP与CDC42的相互作用；(F)
通过Co-IP检测RKIP对ARHGAP与CDC42直接结合的影响；(G) 通过Co-IP检测RKIP与ARHGAP的直接相互作用。

为阐明RKIP调控破骨细胞生成的机制，研究人员通过RNA-seq分析发现RKIP缺失导致细胞粘附相关通路显著富集（图3A）。进一步通过IP-MS技术鉴定出RKIP与CDC42直接相互作用（图3B）。功能实验显示RKIP缺失显著抑制RANKL诱导的CDC42活性上调（图3C），免疫荧光染色证实二者在细胞膜及核内存在共定位（图3D）。

机制研究表明，RKIP通过竞争性结合ARHGAP（一种促使CDC42由GTP向GDP转化、进而使其失活的GAP蛋白），削弱其与CDC42的相互作用（图3E-F），从而维持CDC42活性状态。该竞争性调控模型通过RKIP与ARHGAP的直接相互作用实验获得证实（图3G）

综上，RKIP通过竞争性结合结合ARHGAP，从而阻止CDC42-GTP被水解成CDC42-GDP，维持了CDC42的活性状态。而活跃的CDC42进而驱动下游的细胞骨架重组和细胞融合，最终促进破骨细胞生成。

4.RKIP通过与ARHGAP相互作用来促进破骨细胞的生成

图4 RKIP调控巨噬细胞的分化方向，并影响H型血管的形成

(A) 通过单细胞转录组分析巨噬细胞亚群（UMAP图）；(B) 通过AUCell评分分析促血管生成基因集活性；(C) 比较小鼠促血管生成巨噬细胞占；(D) 通过qPCR检测促血管生成基因mRNA表达水平；(E) 通过基质胶成管实验评估血管生成能力；(F) 通过免疫荧光染色观察H型血管形成情况。数据以均值±标准差的形式呈现。*P < 0.05，**P < 0.01。

在骨生物学领域，“血管-成骨耦合”机制已被证实是独立促进骨形成的重要途径，其中H型血管（CD31hiEmcnhi）发挥着关键作用。基于前期发现的RKIP缺失抑制破骨分化却增强骨形成的矛盾现象，研究人员提出科学假设：RKIP缺陷的巨噬细胞是否通过促进H型血管生成间接驱动骨形成？

通过单细胞转录组测序分析骨髓细胞，鉴定出12个巨噬细胞亚群（图4A）。采用AUCell算法对促血管生成基因集进行活性评分，定义7个促血管生成巨噬细胞亚群（图4B）。定量分析显示cKO组中该类细胞比例显著增加（图4C）。

功能验证表明：gKO来源的骨髓巨噬细胞中促血管生成因子转录水平显著上调（图4D）；其条件培养基显著增强内皮细胞成管能力（图4E）；cKO小鼠骨组织中H型血管数量显著增多（图4F）。

这些结果表明RKIP缺失驱动巨噬细胞向促血管生成亚群分化，通过上调促血管生成因子表达促进H型血管形成，最终通过"血管-成骨耦合"机制促进骨形成。

5.RKIP通过与ARHGAP相互作用来促进破骨细胞的生成

图5 巨噬细胞核内RKIP调控HIF-1α的稳定性进而调控血管生成

(A) 通过免疫荧光染色检测RKIP与HIF-1α的亚细胞定位；(B) 通过Western blot检测蛋白酶体/溶酶体途径对HIF-1α稳定性的影响；(C) 通过免疫共沉淀检测HIF-1α的泛素化水平；(D) 通过邻近连接实验检测RKIP与VHL/HIF-1α的相互作用；(E) 通过免疫荧光检测NLS缺失对HIF-1α核内积累的影响。

基于HIF-1α促进血管生成及其与RKIP潜在相互作用的报道，本研究探讨了RKIP对HIF-1α的调控作用。研究发现巨噬细胞中RKIP缺失显著增加低氧条件下HIF-1α的核内积累（图5A）。过表达RKIP促进HIF-1α降解，此过程可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断（图5C）。泛素化分析显示RKIP缺失显著降低HIF-1α多聚泛素化水平（图5D），证实RKIP通过泛素-蛋白酶体途径调控HIF-1α稳定性。

机制研究表明，免疫共沉淀证实RKIP/VHL/HIF-1α形成三元复合物（图5E）；邻近连接实验观察到核内RKIP与VHL、HIF-1α的相互作用（图5G）；功能实验显示缺失核定位序列的RKIP突变体丧失调控HIF-1α稳定性的能力（图5I-J）。可见，巨噬细胞细胞核内RKIP通过招募E3泛素连接酶VHL并促进其与HIF-1α的结合，精准地负调控HIF-1α的稳定性。

这些结果揭示核内RKIP通过其核定位序列介导核转位，作为分子支架桥接VHL与HIF-1α，增强HIF-1α泛素化降解，从而负调控巨噬细胞的促血管生成能力。

文章总结

1.胞质机制：促进骨吸收

在细胞质中，RKIP作为一个“分子诱饵”，竞争性结合CDC42的GTP酶激活蛋白ARHGAP，从而维持了CDC42的活性。活跃的CDC42进而驱动破骨细胞前体的细胞骨架重组、融合与分化，促进破骨细胞生成和骨吸收。

2.核内机制：抑制骨形成

RKIP通过其核定位序列进入细胞核，桥接E3泛素连接酶VHL与转录因子HIF-1α，增强VHL对HIF-1α的识别与结合，从而促进HIF-1α的泛素化降解，进而抑制了H型血管的生成，最终导致骨形成被间接抑制。