Xenium原位基因表达检测

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Xenium空间原位基因表达平台

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1.聚类分析

获得每张芯片的基因表达矩阵后,使用Seurat软件进行矩阵统计、细胞聚类、筛选Marker基因等分析。
1.1矩阵统计
取bin统计基因表达矩阵中 nCount（transcript数）和 nFeature（基因数），并在样品切片组织的空间位置中进行展示，结果如下：

基因表达矩阵统计
1.2细胞聚类
通过基因的表达矩阵，首先对矩阵数据使用PCA进行降维处理，之后使用UMAP算法进行细胞聚类，并将细胞类群的每个细胞在样品组织切片的空间位置中进行展示，结果如下：
1.3Marker基因
通过Seurat软件分别计算每一类细胞与其他类群的差异表达基因，对得到的Marker基因，统计其在不同细胞类群中的表达情况，使用空间热图、气泡图和小提琴图等方式进行可视化展示，每个细胞类群中Top4基因的结果分别如下：

2.细胞定义

我们使用SingleR软件对Xenium细胞分群进行细胞类型鉴定。SingleR基于已知细胞类型的参考数据集，计算每个spot与参考数据的相关系数（Spearman），以相关系数的80分位数作为该细胞类型的评分，然后截取评分较高的细胞类型的参考数据集，不断重复上述过程对细胞类型标签进行微调（fine-tuning），直到只有一种细胞类型为止；在每次计算相关系数时，只选择所截取参考数据集的高变基因；参考数据集选择HumanPrimaryCellAtlasData（人）或MouseRNAseqData（小鼠）。
细胞类型的鉴定是我们初步理解所研究样本的细胞组成的分析方法，更深入和准确的定义细胞类型则需要结合H&E染色图片和从文献查找感兴趣的细胞类型的标记基因来判断。

细胞类型UMAP展示
我们将细胞定义的结果映射到切片空间上：

细胞类型空间展示

3.空间轨迹分析

我们使用Stlearn软件进行空间轨迹（spatial trajectory）分析，该软件根据Xenium的空间距离，组织形态和基因表达信息，在空间中重建组织内的细胞类型演变（Spatial trajectory inference ）过程，并且不仅可以推断细胞演化的轨迹曲线，还可以研究不同演化阶段的细胞在空间上的分布。
stLearn首先使用基于全组织均一化基因表达数据（利用邻域信息-空间位置和形态距离的均一化方法）的PAGA轨迹分析，用于发现亚群内的联系。然后，利用稳健的轨迹推断方法——扩散伪时间(diffusion pseudotime ，DPT)方法计算伪时间。DPT方法使用类似随机游走的方法来测量细胞到细胞的转移。对于轨迹的方向，用户可以根据组织中正在研究的生物过程来定义根节点。然后结合基因表达值和物理距离计算伪时空距离( pseudo-space-time distance，PSTD)。在此基础上，构建有向图，像monocle一样寻找分支的方法类似：利用有向最小生成树算法对图进行优化，找出图中连接节点最短有根树和分支。
3.1细胞类群展示

不同类群空间分布
3.2轨迹推断结果展示
选定感兴趣的细胞类群，根据人为指定的根节点进行整体的空间轨迹推断，得到的对应不同亚群之间的演化关系及其在空间位置上的迁移和变化，此外还可以根据空间轨迹/树图得到不同分化分支上的高度相关基因（Transition markers）。

轨迹空间分布

4.细胞通讯分析

生物体中，细胞与细胞之间并不是独立存在的，而且作为一个整体，通过细胞之间的“信号”传输来达到细胞之间“沟通”的目的，细胞之间沟通的一种重要方式就是配体和受体的相互作用，因而可以通过已知的配受体对在细胞内和细胞间的表达来评估细胞间的交流，即细胞通讯。我们使用Stlearn进行细胞通讯分析，stLearn可以同时考虑细胞类型在空间上的距离，以及受配体的表达情况推断互作。通过分析揭示两个维度的信息，一是哪些空间区域发生了哪些受配体的互作，二是哪些细胞类型发生了哪些受配体的互作。
4.1 Xenium空间网格化
为了提高运算效率，Stlearn对于Xenium进行网格化处理（分辨率越高就越能代表单个单元数据，但计算时间越长），并保存每个网格的细胞类群比例信息及占主导细胞类群的注释，随后用该注释的细胞类型执行受配体分析。将每个位置的显性细胞类群可视化的结果如下，用以衡量网格化的分辨率是否合理：

空间网格化有效性
4.2受配体分析
Stlearn使用CellPhoneDB中零分布的方法统计邻近细胞间或者细胞类型间受配体互作显著性以及互作强度。我们统计了两两细胞分群间的特异互作的配受体对，并对top的配受体对进行了详细展示：

top4受配体空间表达及细胞类群间展示