小麦作为世界上种植范围最广的粮食作物之一，其产量是全球粮食安全的重要保障。而利用杂交育种技术创制杂交小麦是提高小麦产量的有效途径之一。雄性不育突变体是杂交种子生产的潜在种质。研究表明，雄性不育除编码基因外，还与小麦花药中干扰小RNA(phasiRNAs)有关，但其具体功能和作用机制仍不清楚。

2023年1月，山东省农业科学院作物研究所李根英研究员团队在期刊 Plant Biotechnology Journal 上发表了题为：“CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of TaDCL4, TaDCL5 and TaRDR6 induces male sterility in common wheat〞的研究论文，该研究通过结合CRISPR/Cas9编辑和非编码RNA测序分析，阐明了小麦花粉败育的分子机制，为小麦细胞核雄性不育提供了新的基因资源。该研究中lncRNA、small RNA的测序和分析由诺禾致源提供。

文章概况

CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of TaDCL4, TaDCL5 and TaRDR6 induces male sterility in common wheat

发表期刊：Plant Biotechnology Journal

发表时间：2023.01.04

测序技术：lncRNA-seq、miRNA-seq

研究亮点

该研究利用农杆菌介导的CRISPR/Cas9技术，选取了小麦雄蕊发育相关phasiRNA合成路径中的三个关键基因TaDCL4、TaDCL5和TaRDR6并进行精准基因编辑，获得了小麦雄性不育突变体，通过对这些突变体进行非编码RNA测序，发现这三个基因参与了phasiRNA的产生过程，并阐明了其造成花粉败育的原因。这为小麦细胞核雄性不育提供了新的基因资源。

主要研究结果

 01 通过基因组编辑创建dcl4、dcl5和 rdr6突变体 

先前的研究表明，禾谷类植物中phasiRNA合成路径的关键基因为dcl4、dcl5和 rdr6；qRT-PCR分析也表明，小麦中TaDCL4、TaRDR6和TaDCL5在花药的不同发育阶段表达不同，表明它们在小麦花药发育中具有重要作用。为进一步研究其功能，利用基因编辑成功创制了它们的突变体。在小麦中，dcl4基因有三个拷贝，只有同时突变掉这三个部分同源基因，dcl4突变体才会表现出雄性不育的表型，即花药瘦小，花粉粒少，碘化钾染色后呈黄色。此外，除雄性不育外，dcl4突变体的植株矮小，穗子变小。 rdr6基因在小麦中只有两个拷贝，位于chr3B和chr3D染色体上。当两个部分同源基因的编辑效率同时达到75％以上时，rdr6突变体表现出约一半分蘖可育，一半分蘖不育；当编辑效率接近100％时，种子萌发率变低，萌发出来的突变体分蘖数偏多并将终生处于幼苗期。dcl5基因在小麦中有三个拷贝，位于chr1A、chr1B和chr1D染色体上。DCL5-1B的DEAD结构域偏小，并且不含Helicase_C和Dicer_dimmer这两个结构域。当DCL5-1D突变率达到70％以上时，dcl5突变体表现出雄性不育的表型。除此之外，在dcl5突变体中未观察到其他的不利农艺性状。

图1 基因组编辑创建dcl4、dcl5和rdr6突变体

 02 dcl4、dcl5和rdr6影响小麦的减数分裂和小孢子发育 

通过对减数分裂期花粉母细胞的染色体压片，发现在dcl4和rdr6小麦突变体中，均只有部分花粉母细胞可以通过减数分裂过程，因此可观察到的成熟花粉粒较少。在减数分裂的配对和染色体排列在赤道板上这两个时期，dcl4突变体的个别染色体发生滞后，并在二分体和四分体时期，出现多核现象，最终导致细胞分裂的异常。rdr6突变体主要表现为二分体和四分体分裂时细胞间有黏连，不能彻底分离。dcl5突变体的减数分裂过程正常，但当四分体分化为小孢子后，在小孢子出现萌发孔后，开始变得异常，最终也不能发育为成熟的小孢子，此外有部分小孢子出现了两个萌发孔。

图2 对减数分裂期花粉母细胞的染色体进行压片

 03 PhasiRNA在生殖阶段的生物合成及作用机制 

通过对小麦幼穗期的小分子RNA测序，发现dcl4突变体中未检测到21-nt phasiRNA，dcl5突变体中未检测到24-nt phasiRNA，而rdr6突变体中只检测到少量的21-nt和24-nt phasiRNA。这说明在小麦中dcl4和dcl5分别参与了21-nt和24-nt phasiRNA的产生，而rdr6同时参与了二者的产生过程。通过靶基因预测，发现phasiRNA可以靶向编码和非编码RNA。通过对phasiRNA作用模式的研究发现，RNA切割是phasiRNAs作用于靶转录本的主要方式之一。对phasiRNA下游靶基因进行功能富集分析表明，靶基因在蛋白质修饰、碳水化合物生物合成和 ncRNA 代谢等基本生物过程的功能以及生殖过程的调节方面得到了富集，有些靶基因功能主要富集在了减数分裂过程，比如微管的移动、核和染色质的甲基化修饰等；而有些靶基因则参与绒毡层的分化，花粉壁的发育，以及孢粉素（小孢子和花粉外壁的主要成分）的代谢过程。

图3 PhasiRNA靶基因富集分析

 04 多倍体小麦PHAS基因的分化 

为了进一步了解phasiRNA在物种的保守性，作者通过与水稻基因组比较，发现只有约1.47％的21-PHAS位点和4.99％的24-PHAS位点能够比对到水稻基因组上。这表明禾谷类物种中PHAS基因保守性很低，但小麦和水稻之间存在共同的靶标。通过与小麦祖先种AA、AABB、DD和BB基因组的比较分析发现，存在多于60％的来自各亚基因组上的PHAS位点可以比对到祖先种的基因组上，但它们在小麦的各亚基因组间却具有非常低的保守性，这说明PHAS位点在六倍体小麦合成之前就发生了高度的分化。

图4 多倍体小麦PHAS基因的分化

结论

在本研究中，作者发现pahasiRNA广泛参与雄性配子体发育，并严格依赖于TaDCL4、TaDCL5和TaRDR6。研究揭示了phasiRNA生物发生的基因及其前体和靶基因的功能。这些发现为小麦配子体发育提供了重要的见解，并为小麦细胞核雄性不育提供了新的基因资源。

参考文献：

 Zhang, R., Zhang, S., Li, J., Gao, J., Song, G., Li, W., Geng, S., Liu, C., Lin, Y., Li, Y. and Li, G. (2023) CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of TaDCL4, TaDCL5 and TaRDR6 induces male sterility in common wheat. Plant Biotechnol J., https://doi.org/10.1111/pbi.14000.