马作为研究后肠发酵食草动物消化的模型系统，其马肠道的微生物组成如何？马肠道微生物组和马性能之间存在什么关系？为回答这些问题，石河子大学胡圣伟教授带领他的团队，利用高通量测序技术与长读长测序相结合的宏基因组策略在期刊 Microbiome 上发表了题为：“Expanded catalogue of metagenome-assembled genomes reveals resistome characteristics and athletic performance-associated microbes in horse〞的研究论文（IF：16.837）。该研究由多家单位研究人员共同协作完成。石河子大学李村院博士、李晓悦博士为论文的共同第一作者。石河子大学胡圣伟教授、倪伟教授、北京诺禾致源科技股份有限公司刘臣为论文的共同通讯作者。

研究背景

马作为运动、休闲、食品生产和运输的机械能来源，在世界各地被广泛饲养。肠道菌群在马的健康、疾病、运动表现和行为中起着重要作用。因此，详细了解马的肠道菌群组成和功能从而潜在地改善马在人类活动中的使用是非常重要的。宏基因组测序技术可以在肠道微生物中识别出大量以前未知的细菌种类，并已被用于在基因组水平上表征这些微生物的功能。另外，三代测序可以通过长读长的优势来提高组装质量。目前，使用高通量测序技术与三代长读长测序相结合，为表征马微生物组的组成和功能提供了一种有前景的策略。
研究思路
具体研究思路如下：

研究结果

01 马肠道宏基因组集构建

1.1 测序与组装

作者对来自242匹马的110个盲肠和132个直肠（粪便）样本进行 Illumina测序。这些马是保持在不同的饮食条件下的，且涉及到了不同年龄（1-11岁）、不同性别（雌性、雄性）和不同品种（纯种马、伊犁马、伊犁赛马、藏马或设特兰矮种马），获得了2.264 Tb clean Data。作者还利用三代测序对两个样品（HGM35和HGM77）进行了测序，获得了0.057 Tb的长读长数据。

本文使用二代和三代测序技术总共组装了4142个MAG（Metagenome-Assembled Genome）。其中，2272个是高质量基因组（定义为完整性>80%和污染率<10%）（图1B）。

1.2 对4142个MAG进行分类

这些MAG序列与基因组分类数据库（GTDB）进行比对。4142个MAG中有3253个MAG可以被认为是物种水平的基因组。所有4142个MAG均被分类为GTDB预测的分类群（图1C）。4015个MAG（>96.93%）属于本研究中首次鉴定的未知物种或菌株。

在这项研究获得的15个古菌MAG中，有13个属于未知物种。作者研究发现MAG23.bin.19（被鉴定为Methanobrevibacter smithii）可能是马甲烷产生的主要贡献者，Methanobrevibacter smithii的完整基因组信息可能为减少甲烷产生提供新的靶点。

图1 MAG构建流程及组装的MAG的基本信息(A) 242个马的基本信息和使用Illumina和Nanopore技术从242个马宏基因组数据集构建MAG流程示意图。(B) 基因组完整性的分布和MAG按质量等级的分类。(C)来自马肠道的4142个 MAG的系统发育树。

02 从长读长数据中组装出了13个新物种对应的第一个完整的环状基因组

两个样本进行了三代测序，产生了超过50.13 Gb的clean data。在组装这些long reads后，得到了一个长度为739 Mb的序列，N50值达到217kb。与二代数据相比，三代测序数据在组装长度和contig长度方面具有优势。long reads可用于组装近乎完整的环状MAG（cMAG），这大大提高了组装的精度。在long reads生成的32个新的高质量MAG中，有13个成功组装成了cMAG。作者将这13个cMAG与NR数据库和GTDB-Tk比对并进行ANI分析，发现这些cMAG是各自物种的第一个环状的完整基因组，最终还确定MAG77.2876332.NO.18是一个新物种。三代宏基因组数据的组装不仅增加了基因组组装的完整性，而且还揭示了以前未解决的基因组特征和分类信息。

图2 从长读长数据组装出第一个完整的环状基因组

(A) Illumina和Nanopore序列组装结果的三个重要指标的统计分布。(B) 2个环状基因组概述。

03 发现数十万种新的CAZy基因

作者通过搜索KEGG和CAZy数据库来分析马肠道宏基因组的蛋白质组学和功能。2272个高质量MAG总共包含4,632,123个预测蛋白质，其中6.77%（313,568）被预测至少具有一个CAZy功能（图 3A）。这些蛋白质在鉴定到的分类群基因组中分布不均匀。例如，GH和GT尤其富集在Verrucomicrobiota和Firmicutes中（图3B）。作者进一步分析了预测的CAZymes与当前CAZy数据库的相似性，发现预测的蛋白质中有187,429个是新的CAZy（图3C），还发现新型CAZy和潜在的纤维素降解细菌的鉴定有助于更好地了解马肠道中的碳水化合物代谢，并为发酵生物技术行业提供丰富的新型酶和微生物来源。

图3 马肠道中MAG的功能注释

(A) 马肠道微生物蛋白的功能注释。(B) CAZy分布的热图。(C) 本研究中CAZy与公共数据库的序列同一性。(D) CAZy基因数量与先前研究的比较。

04 构建马肠道的抗生素抗性基因库

本研究检测了242个马肠道样本中2272个高质量MAG中ARG的分布，总共确定了266种独特类型的ARG（图4A）。之后，作者随机选择的10个ARG通过实时RT-PCR验证了这些ARG的转录活性，表明这些预测基因具有真正的抗性功能（图4B）。Escherichia coli菌株（MAG166.bin.2）含有属于13个药物类别的82种独特类型的ARG（图4C），这一发现表明该菌株可能是一种潜在的超级耐药细菌。作者对六个马品种（伊犁马、纯种马、设特兰小马、藏马、伊犁非赛马和伊犁赛马）肠道中ARG流行率进行成对比较。伊犁马的样本量最大，但伊犁马中ARG的数量和丰度并不是最大的。纯种马的ARG丰度和数量最高，是藏马的两倍多（图4D，E），藏马肠道中ARG的丰度和数量最低。

图4 马肠道作为抗生素抗性基因的储存库

(A) ARG分布热图。(B) 随机选择的10个ARG的实时RT-PCR分析结果。(C) ARG的数量排名前20的MAG中抗性相关药物类别的热图。(D) 不同品种的马肠道微生物中ARG的基因数量。(E) 不同品种的马肠道微生物中ARG的相对丰度。

05 对赛马肠道中潜在提升运动能力的微生物提出新见解

为了揭示赛马肠道菌群与运动表现之间的联系，作者研究了精英赛马（n = 21，伊犁赛马）和一组年龄匹配的非赛马（n = 35，伊犁马）的微生物组之间的差异。主坐标分析（PCoA）显示，赛马和非赛马的微生物组成明显分离（图5A）。Lachnospiraceae和Ruminococcus是赛马中高丰度的微生物（图5B），含有许多乙酸盐和丁酸盐合成途径中的关键酶。乙酸盐和丁酸盐合成途径中的关键酶（EC 1.2.7.1、EC 2.3.1.54等）在赛马肠道中显著富集（图5D）。更重要的是，36个MAG在赛马中高于非赛马。伊犁赛马中富集的MAG含有生产乙酸盐和丁酸盐的主要途径中的所有基因。这些结果表明，在赛马肠道中富集的微生物可能合成更多的醋酸盐和丁酸盐。

图5 赛马肠道中具有潜在提升运动能力的微生物分析

(A) 通过PCoA可视化赛马和非赛马肠道微生物群的差异。(B) 赛马和非赛马中差异丰度最高的30个MAG。(C) 在赛马中富集的细菌在乙酸盐和丁酸盐合成途径的每一步都含有关键酶。(D) 柱形图显示了赛马和非赛马之间参与乙酸盐和丁酸盐合成的关键酶的差异。(E) 乙酸盐和丁酸盐处理显著改善小鼠的运动性能。

本文亮点

本文使用了来自中国两个省的242匹马的肠道样本，进行了大规模宏基因组数据分析，以表征马肠道中的微生物组成。此外，作者还揭示了马体内的抗性特征和与运动表现相关的微生物。这项研究提供了马肠道MAG的详细目录，并回答了有关马肠道微生物组和马性能之间关系的重要问题。