人类和圈养猕猴都存在慢性顽固腹泻，并有着较高的发病率和死亡率。四川大学生命科学学院李静、范振鑫老师及其团队今年在 Microbiome 上发表题为“The gut microbiome and antibiotic resistome of chronic diarrhea rhesus macaques (Macaca mulatta) and its similarity to the human gut microbiome”的文章，将长期慢性腹泻猕猴与无症状猕猴的新鲜粪便作为研究材料，通过宏基因组测序分析了慢性腹泻猕猴的肠道微生物群和抗生素耐药性及其与人类肠道微生物的相似性，揭示了慢性腹泻相关机制，以提高慢性腹泻的诊断和治疗水平。其中宏基因组测序服务由诺禾致源提供。

文章介绍

The gut microbiome and antibiotic resistome of chronic diarrhea rhesus macaques(Macaca mulatta) and its similarity to the human gut microbiome

慢性腹泻猕猴的肠道微生物组和抗生素耐药性及其与人类肠道微生物组的相似性

发表杂志：Microbiome

影响因子：16.837

发表时间：2022.2

发表单位：四川大学

研究背景

慢性腹泻是引起圈养猕猴（RMs，Macaca mulatta）发病率和死亡的常见疾病。RMs的慢性腹泻典型特征是长期腹泻和对抗生素治疗的反应较弱。腹泻也是人类的一种常见疾病，可导致死亡。然而，大约一半的人类腹泻病例的病因仍不清楚。因此，本文通过宏基因组测序来表征慢性腹泻 RMs和无症状个体的肠道微生物组和耐药组的差异及腹泻猕猴与人类肠道微生物的相似性。

技术路线

材料与方法

试验材料：11例慢性腹泻RMs与18例无症状RMs

测序方法：宏基因组

测序测序平台：Illumina

试验方法：细菌分离及耐药表型检测

研究结果

1. 慢性腹泻RMs和无症状RMs的肠道微生物组成

比较了无症状RMs和慢性腹泻RMs的肠道微生物群，以表征肠道微生物组成的差异。发现有7个优势门，在至少一个样本中相对丰度超过1%，分别为厚壁菌门（17.9–87.0%）、拟杆菌门（3.1–36.0%）、变形菌门（2.8–76.2%）、放线菌门（1.2–24.9%）、螺旋体门（0.1–12.8%）、疣微菌门（0.03–15.65%）和柔膜菌门（0.08–1.91%）。基于属水平相对丰度剖面的PCoA图显示，PCoA1解释了43.23%的变异性，PCoA2解释了21.44%的变异性。PCoA图表明，无症状RMs和慢性腹泻RMs的样本几乎完全分开(图1A)，基于PCoA图比较了不同年龄和性别的RMS的肠道微生物组，结果表明所有样本都是按腹泻疾病分离的，而不是按年龄和性别分开的。使用LEfSe分析比较了无症状和慢性腹泻RMs在属水平上的相对丰度（图1B）。只有乳酸菌、链球菌、短螺旋菌、幽门螺杆菌等4个属在无症状RMs的肠道中明显更丰富（p < 0.05和LDA > 3）。慢性腹泻RMs中拟杆菌、梭状芽孢杆菌、粪杆菌、罗氏菌、柯林斯菌等属更为丰富（p < 0.05和LDA > 3）。

图1 慢性腹泻和无症状RMs的肠道微生物组成

2. 慢性腹泻RMs与无症状RMs之间的肠道微生物群功能差异比较

利用HUMAnN2对微生物基因家族和代谢途径的丰度进行量化，以比较肠道微生物群的功能差异。基于基因家族丰度的PCoA图显示，无症状RMs和慢性腹泻RMs的样本在空间上几乎完全分离（图2A）。无症状RM肠道微生物群的代谢途径在SCFAs和l-抗坏血酸的产生中富集（图2B）。为了进一步表征肠道微生物群的整体功能，我们基于KEGG数据库对肠道微生物群的基因功能进行了预测。无症状RMs和慢性腹泻RMs肠道微生物群中最丰富的基因与代谢相关，特别是碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢以及能量代谢（图2C），且在无症状RMs的肠道微生物组中明显高于慢性腹泻RMs的肠道微生物组（p < 0.01）。由于RMs肠道中碳水化合物代谢相关基因的丰度很高，在CAZy数据库的基础上预测了肠道微生物组的碳水化合物活性酶(CAZymes)，以进一步了解肠道微生物组的CAZymes活性。在无症状的RMs肠道微生物组中，CAZymes的总基因显著多于慢性腹泻RMs肠道微生物组(图2D)。值得注意的是，编码CBMS、GHS和PLS的基因在无症状RMS的肠道微生物群中更为丰富(图2E)，发现GH13是在无症状和慢性腹泻RMS的肠道中最常见的GH家族(图2F），然而，无症状RM肠道微生物组中GH13的相对丰度明显高于慢性腹泻RM肠道微生物组。此外，大多数GH家族，如GH1、GH43、GH3、GH23和GH25，在无症状的RM肠道微生物群中明显更丰富。

图2 慢性腹泻与无症状 RMs 肠道微生物群的功能比较

3. 圈养非人灵长类动物（NHPs）与人类肠道微生物群的比较

比较了无症状RMs、圈养猕猴、圈养藏酋猴、圈养长尾猴、圈养黑猩猩、非西化饮食人类和西化饮食人类的肠道微生物组成。乳酸菌在所有NHPs的肠道中普遍存在，但在人类的肠道中很少(图3A)。属水平相对丰度的PCoA图表明，几乎所有的NHP样本(特别是长尾猴、黑猩猩、大猩猩)在空间上与非西化饮食的人类样本接近(图3B)，每个圈养的NHP的肠道微生物群与非西方化饮食的人类的类似程度高于采用西方化饮食的人类（图3C）。比较了无症状RMs、慢性腹泻RMs、炎症性肠病患者、急性腹泻患者（来自农村和城市人口）和健康人类（即非西方化和西方化饮食）的肠道微生物群。基于属水平相对丰度的PCoA图表明，这些人类样本主要是由饮食而不是疾病聚集的（图3D）。此外，农村急性腹泻人和城市急性腹泻人样本在PCoA图中相距较远。慢性腹泻RMs的样本与农村腹泻患者和非西方化饮食的人类样本更接近（图3D）。

图3 非人灵长类与人类肠道微生物群的比较

4.  RMs肠道微生物群的抗生素抗性基因（ARGs）和耐药表型 

慢性腹泻RMs肠道中ARGs的总丰度显著大于无症状RMs肠道（图4a）。基于ARGs丰度的PCoA图显示，几乎所有无症状RMs和慢性腹泻RMs的样本在空间上都是分离的（图4B）。编码四环素类抗生素耐药性的 tetQ 基因在无症状和慢性腹泻猕猴的肠道微生物群中最为普遍（图4C）。RMs肠道微生物群中ARGs的主要种类为四环素、林可酰胺/大环内酯/链霉菌素类抗生素、氨基糖苷类抗生素、头霉素和苯酚类抗生素（图4D）。为了进一步验证抗生素耐药性，检测了圈养猕猴粪便和组织分离株的耐药表型。从慢性腹泻RMs的粪便、无症状RMs的粪便和1例死亡腹泻猕猴的组织液中分离到31株大肠杆菌、29株肺炎克雷伯菌、16株奇异变形杆菌、2株产气克雷伯氏菌和2株类肺炎克雷伯菌。几乎所有来自慢性腹泻的粪便和组织液中分离株均对FFC（49/51）、TE（48/49）、K（48/51）、CIP（55/58）、KZ（54/58）、OFX（55/58）和AMP（57/58）耐药（图4E)。

图4 慢性腹泻RMs和无症状RMs的耐药性

研究结论

慢性腹泻与无症状RMs的肠道微生物群存在显著差异；频繁使用抗生素会导致RMs肠道产生抗生素耐药性，从而严重影响慢性腹泻的治疗；从RMs肠道中分离出的有益乳杆菌可以被视为一种潜在的益生菌，在未来的研究和治疗中可以预防或缓解RMs腹泻；包括RMs在内的圈养NHP与非西化饮食人类在肠道微生物组成上有更大的相似性。这表明，腹泻型RMs可以被认为是研究非西式饮食下人类腹泻的合适模型。总体而言，这项研究让我们更清晰的了解慢性腹泻RMs的肠道微生物群和抗生素耐药性。

文章亮点

该研究证明，慢性腹泻显著改变了RMs肠道微生物组的组成和代谢途径；来自RM肠道的有益乳酸菌可能是一种预防或缓解RM腹泻的潜在益生菌；腹泻型RMs可以被认为是研究非西式饮食下人类腹泻的合适模型，本研究将有助于提高RMs腹泻的诊断和有效防治水平。

参考文献：

[1] Yang Shengzhi., Liu Yu., Yang Nan., Lan Yue., Lan Weiqi., Feng Jinyi., Yue Bisong., He Miao., Zhang Liang., Zhang Anyun., Price Megan., Li Jing., Fan Zhenxin.(2022). The gut microbiome and antibiotic resistome of chronic diarrhea rhesus macaques (Macaca mulatta) and its similarity to the human gut microbiome. Microbiome, 10(1), 29. doi:10.1186/s40168-021-01218-3