一、背景

N6-腺苷酸甲基化（m6A）是真核生物和病毒中较常见的mRNA修饰方式，一旦参与m6A修饰的酶出现异常将会引起一系列疾病，包括但不限于肿瘤、神经性疾病、胚胎发育迟缓等。研究表明：m6A甲基化在致癌病毒复制中发挥关键调控作用^[1]。然而由于缺乏合适的动物模型，在宿主体内的调控作用机制尚不清楚。

2022年11月，河南农业大学张改平院士科研团队在期刊 Journal of Medical Virology 上发表了题为“Infection phase-dependent dynamics of the viral and host N6-methyladenosine epitranscriptome in the lifecycle of an oncogenic virus in vivo”的研究论文，该研究利用马立克氏病病毒（MDV）构建的动物模型在国际上首次全面系统地揭示了RNA表观遗传修饰参与调控疱疹病毒在动物体内裂解性感染、潜伏感染、肿瘤形成和再激活感染的过程，并利用生物信息学技术解析疱疹病毒体内复制及致肿瘤的潜在调控机制。其中，诺禾致源提供专业的的m6A建库测序分析服务。

二、文章概况

Infection phase-dependent dynamics of the viral and host N6-methyladenosine epitranscriptome in the lifecycle of an oncogenic virus in vivo

发表期刊：Journal of Medical Virology

影响因子：20.693

测序技术：MeRIP-seq、RNA-seq

研究方向：不同感染阶段病毒和宿主转录组m6A修饰变化

样本情况：特异性无病原体(SPF)鸡、感染MDV鸡的组织（脾脏，肝脏，胸腺和法氏囊）

三、研究路线

四、主要研究结果

1. MDV复制动态改变体内m6A修饰蛋白的表达

该研究收集了不同时间点感染MDV和未感染的SPF鸡脾脏样本用于研究宿主m6A蛋白对与MDV感染的反应（体内外）。Western-blot（WB）发现溶细胞期METTL3和METTL14的表达显著降低，潜伏期细胞中METTL3和METTL14的表达高于溶细胞期低于未感染期，两组细胞中FTO和ALKBH5的表达相对于未感染细胞来说无明显变化。由于m6A与肿瘤形成相关，WB发现肿瘤中METTL3和METTL14的表达明显高于溶细胞期，METTL14的表达高于潜伏期，表明m6A修饰在MDV诱导的肿瘤形成中，m6A蛋白在不同感染时期的选择性表达可能促进肿瘤的形成。在重新激活的MSB1细胞（一种具有潜在MDV感染的鸡T细胞）中，与转录水平变化一致，m6A水平也随着感染阶段而变化。以上结果表明MDV的体内复制改变了m6A修饰蛋白的表达。

图1 WB检测MSB1细胞内m6A相关蛋白表达情况

2. m6A修饰的病毒转录本可能与病毒感染不同阶段的病毒复制有关

为探究MDV体内感染周期内病毒转录本动态变化，在溶细胞期对感染MDV以及未感染的脾脏检测了病毒基因表达情况，在MDV感染的脾脏中检测到到至少80个在未感染脾脏中无表达的病毒基因。MeRIP-seq结果表明，溶细胞期细胞和MDV诱导的脾脏肿瘤中分别检测到丰富、大量的m6A修饰的病毒转录本，其中大多数比对到病毒基因组的UL和US区域，而未感染中并未检测到。大多数MDV基因在潜伏期沉默，且潜伏期脾脏中也未发现m6A修饰的病毒转录本。MSB1细胞中MDV基因很少表达，而潜伏的MSB1细胞和MDV溶细胞期中最显著的m6A峰都比对到了病毒的基因组UL和US区域，且潜伏期MSB1细胞中m6A修饰的转录本与MDV肿瘤转化期m6A修饰的转录本基本相同。因此，在病毒感染的不同阶段，m6A修饰的病毒转录本可能与病毒感染不同阶段的病毒复制有关。

图2 体内MDV的m6A可视化

3. 体内MDV复制改变了细胞m6A表观修饰，不同感染时期宿主m6A修饰改变

为了确定MDV在感染的不同时期如何改变宿主表观修饰，该研究分析了感染脾脏细胞中的宿主基因表达情况。与对照组相比，MDV溶细胞期脾脏细胞中基因有591个上调和339个下调，潜伏期细胞中基因有84个上调和93个下调，肿瘤形成期基因有1530个上调和2125个下调。不同时期m6A测序结果发现大多数细胞m6A相关峰在溶细胞期、潜伏期和肿瘤转化期高度保守。富集分析确定了17条保守的信号通路，其中大多数与MDV复制有关。通过比较不同感染时期的转录组和m6A变化，发现不同时期基因的m6A修饰水平不同，MDV诱导的肿瘤形成在宿主表观组学中的变化相较于潜伏期和溶细胞期来说更大，且MDV感染过程中宿主基因的表达水平和修饰水平均有显著的差异。这些不同时期的差异修饰基因与免疫应答相关，表明m6A修饰可能在MDV感染期间调节宿主免疫中发挥重要作用。

图3 m6A peak在不同区域的分布

4. 潜伏期转换成溶细胞期引起了细胞m6A表观转录组的动态变化，METTL3或METTL14过表达降低了MDV复制，而下调则增强了MDV复制

使用MSB1细胞作为模型，联合转录组及MeRIP-seq数据，并结合MeRIP-qPCR验证，表明m6A修饰可能参与调控MDV再激活的细胞通路。潜伏期和溶细胞期的MSB1细胞中m6A修饰的转录本中有“GGAC”显著的motif，主要富集于终止密码子附近，而潜伏期转换溶细胞期的过程中在终止密码子和3’UTR区域m6A峰的数量明显增加。因此MSB1细胞中MDV感染再激活期间m6A修饰分布的变化可能反映了MDV诱导肿瘤形成的不同阶段；且m6A修饰可能调控3‘UTR区域较强甲基化的基因的表达进而调控潜伏期和溶细胞期间的转换。富集分析进一步证明m6A修饰介导参与MDV诱导肿瘤形成的细胞分子通路。

早期实验表明，MDV感染改变了体内METTL3和METTL14的表达。为进一步确认METTL3和METTL14的外源表达是否会影响MDV复制，作者利用METTL3或METTL14过表达质粒转染CEF细胞，48小时后再用MDV感染的细胞进行探究，结果发现METTL3或METTL14过表达减少了MDV的复制，而METTL3或METTL14敲低增强了MDV的复制。

五、结论

本研究利用MDV感染动物模型分析了不同感染阶段病毒和宿主转录组m6A修饰变化，发现m6A修饰参与调控病毒复制和致肿瘤过程。具体而言，甲基化转移酶METTL3/14复合物在MDV生命周期的裂解和再激活阶段被抑制，而在潜伏阶段和MDV诱导的肿瘤中其表达增加。METTL3/14过表达抑制MDV基因表达和复制，而METTL3/114敲低则增强MDV基因的表达和复制。这些发现揭示了病毒体内复制过程中m6A修饰程序的动态特征，特别是与肿瘤发生相关的关键途径。本研究首次报道m6A修饰在疱疹病毒体内诱导肿瘤发生中的作用，对揭示肿瘤发生分子机制有重要理论意义。

参考文献
[1]Tsai, K., & Cullen, B. R. (2020). Epigenetic and epitranscriptomic regulation of viral replication. Nature Reviews Microbiology. doi:10.1038/s41579-020-0382-3