日前，来自新加坡国立大学癌症科学研究所的Amanda S和Tan TK等人在Nature Communications杂志上发表了名为“IRF4 drives clonal evolution and lineage choice in a zebrafish model of T-cell lymphoma”的研究论文，作者使用斑马鱼模型证明了IRF4在体内的致癌性，以及它对T细胞发育和克隆进化的潜在影响。该研究中的单细胞转录组测序服务由诺禾致源提供。

【发表期刊】Nature Communications

【影响因子】14.919

【发表单位】新加坡国立大学

    研究背景    转录因子IRF4是干扰素调节因子（IRF）家族的成员，是一种重要的免疫调节因子。IRF4的表达水平高度受限于造血和脂肪细胞谱系，其水平在终末分化的淋巴细胞中达到顶峰。IRF4也被认为是各种成熟淋巴肿瘤中的致癌基因，通过转录调节下游靶基因激活致癌途径。体外研究表明IRF4可能是一个驱动癌基因。然而研究IRF4体内致癌特性的转基因动物模型还尚未建立。
    研究路线    

    主要结果    

野生型IRF4的过表达在斑马鱼中诱导侵袭性肿瘤

作者首先构建了过表达人类IRF4和荧光标记mCherry基因的转基因斑马鱼模型Tg(lck:IRF4)（图1），并监测了转基因动物的表型。因为多个独立的 F0 动物表现出相同的表型，作者得出结论，肿瘤是由IRF4过表达诱导的，而不是由于转基因随机整合的非特异性效应。

作者又将Tg(lck:IRF4)和表达与人类类似的反式激活死亡p53变体突变 (M214K) 的p53突变鱼进行杂交。肿瘤发生率和外显率的显着差异证明了p53突变和IRF4过表达之间的协同作用诱导肿瘤发生。该结果还表明，一个突变p53等位基因的存在能够加速肿瘤发生，这表明除了野生型功能的丧失外，突变p53还具有潜在的致癌作用，和人类癌症中的研究结论类似。

图1

IRF4驱动的斑马鱼肿瘤概述了侵袭性人类T细胞淋巴瘤

作者接下来检查了IRF4诱导肿瘤的临床病理学特征，使用斑马鱼的全身切片对肿瘤进行组织病理学分析。发现异常细胞大量浸润皮肤、脊髓、鳃、骨骼肌和肾脏。p53突变导致更有侵袭性的肿瘤在更早的时期入侵到多个器官中，尤其是表皮、真皮和皮下组织。这些发现概述了侵袭性人类T细胞淋巴瘤，特别是几种经常侵袭性地浸润到皮肤区域的外周T细胞淋巴瘤。

不同淋巴细胞分化阶段的多细胞群鉴定

为了确定肿瘤细胞的特定谱系和阶段，作者对1个Tg(lck:mCherry)3月龄正常样本（“对照”）、5个Tg(lck:IRF4;p53^wt/wt)3月龄非肿瘤白血病前期样本（“P_IRF4”）、3个早期和6个晚期Tg(lck:IRF4;p53^wt/wt)肿瘤样本（“E_IRF4”和“L_IRF4”），以及5个晚期Tg(lck:IRF4;p53^wt/mut)肿瘤样本（“L_MUT”）进行了单细胞测序（图2A）。作者通过流式细胞仪对斑马鱼全身细胞进行mCherry阳性细胞分选，并进行单细胞捕获、建库和测序分析，平均每个样本5,497个细胞。对照样本根据T细胞不同阶段被分为CD4/CD8双阴性（DN）、CD4/CD8双阳性（DP）、CD4单阳性（4SP）和CD8单阳性（8SP）（图2B），其中比例最高的是DP T细胞。一部分DN细胞显示trgc或trdc的单一表达或二者共表达，这些基因与人类TCR-γ和TCR-δ恒定区域同源，根据之前研究结果它们是DN细胞的中间阶段。结果表明lck启动子驱动的转基因在正常T细胞和B细胞的不同阶段表达。

肿瘤发生过程中DN和TCR-γ阳性T细胞的扩增

作者通过合并数据来可视化每个细胞群在肿瘤进展不同阶段的分布（图2C），发现DN T细胞表达trgc的细胞可能是中间阶段DN T细胞或异常trgc表达T细胞。trgc阳性细胞在许多肿瘤样本的晚期进一步扩增，而其他γδ T细胞比例则保持不变，这与对照样本和白血病前期样本中的比例对比显著（图2D）。作者对20个肿瘤样本进行了独立的qRT-PCR分析验证了这一结果，证实了所有肿瘤样本中trgc表达的上调。因此TCR-γ阳性CD4-/CD8-DN T细胞的扩增对于斑马鱼模型来说是一种独特且常见表型。

图2

IRF4驱动的肿瘤细胞具有恶性特征

为检查增殖细胞是否确实是恶性细胞，作者将Tg(lck:IRF4;p53^wt/wt)分选得到的mCherry阳性细胞移植到免疫功能低下的斑马鱼（rag2^E450fs突变株）中，并监测mCherry阳性细胞的植入和扩增。结果表明移植的细胞含有自我更新的细胞，可以长期产生肿瘤细胞。

此外单细胞测序结果进一步表明p53突变在肿瘤发生的早期阶段赋予多个不同克隆强大的增殖或存活优势，从而导致肿瘤异质性。

 IRF4驱动的肿瘤以mycb和gata3高表达为特征

为了阐明IRF4诱导肿瘤发生的潜在机制，作者使用单细胞测序数据在不同肿瘤阶段的DN群体和选择的基因之间进行了一对一的差异基因表达分析，这些基因显著上调（p<0.05）。还通过ChIP-seq分析了多个大块肿瘤和正常胸腺样本的活性组蛋白标记（H3K27ac）进行了差异表观遗传分析，并进行了差异结合分析。最后通过qRT-PCR验证了mycb和gata3的上调。

p53靶点的下调和抗凋亡基因的上调

作者接下来关注在肿瘤样本的DN群体中显著下调的基因（图3），包括与肿瘤抑制和凋亡途径相关的基因。结合PCR和单细胞测序结果，作者发现p53可能通过不同的机制在功能上受到抑制，促凋亡信号可能占主导地位，因此肿瘤细胞在早期发生细胞凋亡，而在晚期对细胞凋亡产生抗性。

图3

IRF4过表达影响细胞分化和谱系选择

DN细胞中最显著下调的基因之一是id3，它在白血病前期样本中表达，但在肿瘤样本中几乎完全被抑制（图3）。作者还对每个肿瘤阶段之间的DP、4SP和8SP进行了一对一的差异基因分析，发现这些群体的表达谱仍然偏离正常模式。IRF4 阴性人T-ALL细胞系（HPB-ALL）中 IRF4 的强制过表达，其表现出 DP 阶段免疫表型，显著抑制细胞生长并诱导细胞凋亡，表明 IRF4在这个阶段的胸腺细胞过表达可能是致命的，因此 IRF4 阳性 DP 细胞不能扩增。这些结果表明，尽管细胞在 αβ 谱系连续体中分化，但 IRF4 过表达干扰了分化过程。

IRF4驱动的T细胞肿瘤对小分子BRD抑制剂敏感

最后作者在斑马鱼淋巴瘤模型中测试了一种潜在的治疗策略。研究表明，过度表达MYC的癌症对小分子BRD抑制剂敏感，如JQ1。斑马鱼肿瘤在JQ1治疗后表现出显著的反应，与用DMSO处理的对照组相比，肿瘤体积显著减少。总之，数据表明IRF4驱动的肿瘤依赖于转录活性，也证明了该转基因斑马鱼模型在药物测试中的适用性。

研究结论    

本文作者使用斑马鱼模型证明了IRF4在体内的致癌性，以及它对T细胞发育和克隆进化的潜在影响。IRF4转基因斑马鱼发生了具有大量异常淋巴细胞浸润的侵袭性肿瘤，这些异常淋巴细胞扩散到了远端器官。许多晚期肿瘤是单克隆或寡克隆的，且移植后肿瘤细胞可以在受体动物体内扩增，证明其为恶性肿瘤。p53突变加速肿瘤发展，增加外显率，并导致肿瘤异质性。令人惊讶的是，单细胞 RNA 测序显示大多数肿瘤细胞是双阴性T细胞，其中许多表达随着肿瘤进展而占主导地位的 tcr-γ，而双阳性T细胞则大大减少。基因表达和表观遗传分析表明，gata3、mycb、lrrn1、patl1和psip1在肿瘤中被特异性激活，而负责T细胞分化的基因如id3则被抑制。IRF4 驱动的肿瘤对 BRD 抑制剂敏感。

参考文献Amanda S, Tan TK, Ong JZL, et al. IRF4 drives clonal evolution and lineage choice in a zebrafish model of T-cell lymphoma. Nat Commun. 2022;13(1):2420. Published 2022 May 3. doi:10.1038/s41467-022-30053-9