非凋亡性调节性细胞死亡因其能绕过细胞凋亡的优势而成为肝癌治疗领域的研究热点，铜死亡和铁死亡因其独特的金属驱动细胞死亡的方式有望在克服肝癌细胞凋亡抗性方面发挥巨大作用。然而，细胞内铜和铁浓度不足、肿瘤微环境（TME）复杂以及铜死亡和铁死亡之间交叉调节的机制不明严重限制了其治疗效果。

2024年4月，来自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院的张晓领及其研究团队在材料领域顶刊Advanced Functional Materials（IF=19）发表了题为“A Copper/Ferrous-Engineering Redox Homeostasis Disruptor for Cuproptosis/Ferroptosis Co-Activated Nanocatalytic Therapy in Liver Cancer”的文章。本研究构建了一种空心普鲁士蓝 (CHP) 纳米酶，用于装载光敏剂吲哚菁绿 (ICG) 和O₂饱和的全氟己烷 (PFH)，称为O₂-PFH@CHPI纳米颗粒（NPs），用以诱导铜死亡和铁死亡。通过转录组和代谢组分析强调了线粒体介导的抗肿瘤机制，O₂-PFH@CHPI NPs引发的氧化应激可通过干扰肝癌中的线粒体代谢显著引发铜死亡/铁死亡的协同治疗，该研究也为铜/铁工程纳米酶进行铜死亡/铁死亡多模式协同治疗提供了新的指导。文中转录组、非靶向代谢与GM200代谢组检测服务由诺禾致源提供。

研究思路

研究结果

1. O₂-PFH@CHPI NPs的特性

作者通过四步合成程序制备原材料并合成了O₂-PFH@CHPI NPs（图1a），其良好的生物相容性和生物降解性保证了其在体内的安全性。并且其具有POD 样和GPx样催化活性，得益于Cu²⁺到Cu⁺和Fe²⁺到Fe³⁺的价态转变，CHP纳米酶可以实现相关酶底物的循环再生，这有利于持续催化过程以放大氧化应激以进行后续的肿瘤治疗。同时其具有光热控制O₂释放能力，能显著增强肿瘤氧合，达到富氧光动力疗法（Oxy-PDT）的效果。

图1 O₂-PFH@CHPI NPs的合成制备

2. 体外细胞摄取和治疗效果

随后，作者研究了在细胞水平上的体外治疗效果（图2a）。O₂-PFH@CHPI NPs即使在高浓度下也对成纤维细胞无害，并且Huh7肿瘤细胞摄取NPs后其存活率降低，表明了其安全性和较好的治疗效果（图2b、c）。肿瘤细胞中高表达的GSH是不可替代的抗氧化剂，能通过清除ROS来维持细胞氧化还原平衡来保护肿瘤细胞免受氧化应激。O₂-PFH@CHPI NPs则能有效降低GSH的含量（图2f），诱导氧化应激，使Huh7细胞中氧化还原的稳态倾斜，从而达到令人满意的抗肿瘤效果。

图2 体外治疗效果

3. 体外铜死亡和铁死亡评估

在细胞内氧化应激状态增强的推动下，作者进一步研究了铁死亡和铜死亡的表现（图3a）。铁死亡的特征是铁过载、LPO积累和GPX4抑制，提高细胞内ROS生成和诱导GPX4失活是诱发铁死亡的两个重要策略。实验结果显示，O₂-PFH@CHPI NPs+NIR（近红外）处理可显著促进ROS生成和GSH消耗，并且GPX4的表达也低于其他组（图3b）。荧光探针显示该处理组呈现最亮的绿色荧光，表明LPO的有效积累（图3c）。这也表明O₂-PFH@CHPI NPs可以有效抑制GSH/GPX4轴并诱导LPO形成，最终激活Huh7细胞的铁死亡。而O₂-PFH@CHPI NPs+NIR处理使得DLAT聚集并抑制上游FDX1蛋白的表达，从而扰乱线粒体代谢以促进铜死亡（图3e、f）。铜死亡和铁死亡的共同激活密切相关，其在肿瘤治疗中都发挥着不可替代的作用。氧化应激引发的铁死亡/铜死亡可能首先引起线粒体损伤，进而加剧氧化应激，促进铁死亡和铜死亡，从而在Huh7细胞中实现相互增强的治疗效果。

图3 铜死亡和铁死亡的体外评估

4. O₂-PFH@CHPI介导的肿瘤治疗机制

作者通过转录组和代谢组分析以揭示O₂-PFH@CHPI介导的肿瘤治疗潜在分子机制（图4a）。O₂-PFH@CHPI+NIR处理后，共有872个基因发生差异表达（图4b）。GO富集显示这些差异表达基因（DEG）参与了氧化应激或活性氧的反应等（图4e）。GSEA富集分析表明，基因表达的变化与线粒体相关通路呈正相关，包括TCA循环和呼吸电子传递、OXPHOS和线粒体Fe-S簇生物合成（图4g）。KEGG分析还强调了FoxO信号通路，其与ROS之间存在反馈回路。这些表明O₂-PFH@CHPI+NIR通过诱导氧化应激损伤、线粒体功能障碍和炎症反应导致肿瘤抑制。

图4 治疗机制

5. O₂-PFH@CHPI介导的肿瘤治疗的代谢组学分析

作者对O₂-PFH@CHPI+NIR处理引起的代谢组改变进行了分析，TCA循环中重要的产物NADH在O₂-PFH@CHPI+NIR组显著下调（图5c），GSH含量也明显下降，进一步证明了其消耗GSH的能力（图5f）。花生四烯酸和二十二碳四烯酸的显著增加、α-酮戊二酸的积累等也表明了铜死亡和铁死亡通过花生四烯酸代谢途径、糖酵解、氧化磷酸化通路等途径诱导线粒体功能障碍（图5h、i）。

图5 代谢组学数据

6. O₂-PFH@CHPI NPs的体内治疗效果

通过静脉给药小鼠来进一步评估体内的抗肿瘤效果（图6a），作者发现O₂-PFH@CHPI+NIR组肿瘤生长受到了明显的抑制（图6f、g），并且经过14天的治疗后，小鼠的正常器官没有明显的炎症或损伤，证明其治疗的安全性（图6j、k）。H&E染色结果显示，O₂-PFH@CHPI+NIR组的肿瘤坏死最严重（图6i），证实了其强大的杀伤效果。随后作者还评估了铜死亡和铁死亡的体内表现，通过代谢组学的数据得到的关键代谢物变化与体外治疗的变化一致，从而说明了O₂-PFH@CHPI NPs具有令人满意的生物安全性和出色的治疗效果，可用于体内应用。

图6 体内抗肿瘤能力

小编总结

本研究中，作者设计了一种通过破坏细胞内氧化还原稳态并协同铜死亡和铁死亡来治疗肿瘤的治疗策略。为此合成的O₂-PFH@CHPI NPs作为可生物降解的纳米平台，以促进ROS的产生和GSH的消耗。其不仅表现出高温增强的POD样和GPx样催化活性，还表现出Oxy-PDT疗效。其介导的铜死亡和铁死亡通过TCA循环、呼吸电子传递和氧化磷酸化等途径共同诱导线粒体功能障碍，这些通过转录组和代谢组数据得到了验证。该研究也为铜/铁工程纳米酶进行铜死亡/铁死亡多模式协同治疗提供了新的指导。

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本文作者通过非靶向代谢发现了氧化应激相关代谢物产生的变化，后续使用GM200代谢组进行了验证。GM200代谢组是诺禾致源为体外高通量绝对定量小分子代谢物而开发的靶向代谢组学技术，一次检测可对生物样本中的200种代谢物进行绝对定量。涉及的关键通路包括胆汁酸生物合成、脂肪酸生物合成、三羧酸循环、短链脂肪酸代谢等。使用同位素内标法进行定量，200种同位素内标实现真正绝对定量，大幅提升准确度！实现了高通量和高准确性的有机结合，在生物标志物的研究、疾病治疗与预防、肠道菌群相关研究和药物研发和药效评估等领域都有较好的前景和研究价值。

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参考文献

Xiaoling Zhang, Jiuxin Zhu, Sihao Wang, et al. A Copper/Ferrous-Engineering Redox Homeostasis Disruptor for Cuproptosis/Ferroptosis Co-Activated Nanocatalytic Therapy in Liver Cancer [J]. Advanced Functional Materials,2024.