结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球消化系统中最为常见的恶性肿瘤之一，近年来，我国50岁以下的早发结直肠癌（early-onset colorectal cancer，EOCRC）发病率呈逐年上升趋势。尽管生活方式因素如肥胖、吸烟、缺乏运动，以及关键基因APC、TP53和KRAS的分子事件改变，均对早发和晚发（50岁以上）结直肠癌的发生产生影响，但临床观察表明早发结直肠癌更常见于男性、患有炎症性肠病（IBD）或具有家族史的人群，并且多发生于左侧结肠。这些患者往往具有较晚的分期和较差的病理学特征，突显了结直肠癌的发病过程中存在明显的年龄异质性。

癌症基因组图谱（TCGA）计划和临床蛋白质组肿瘤分析联盟（CPTAC）深入描述了结直肠癌（CRC）的分子互作和分型异质等特征，研究主要聚焦于欧洲人群的总体结直肠癌，对我国人群早发结直肠癌（EOCRC）的分子分型及异质性研究仍不完善。

2023年3月，南京医科大学公共卫生学院王美林教授团队在Cell Reports Medicine（IF 14.3）上发表了题为“Integrated multi-omics approach to distinct molecular characterization and classification of early-onset colorectal cancer”的研究。研究采用基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组等全面的多组学分析以及人群异质性分析方法，揭示了早发结直肠癌（EOCRC）的独特分子特征。

研究人员发现，EOCRC肿瘤具有较高的肿瘤突变负荷，表现出在DNA修复能力的突变、转录和翻译等水平上的显著增强。同时，DNA甲基化和拷贝数变异在基因表达的调控中也发挥着显著作用。基于肿瘤突变负荷和免疫微环境评分，研究人员鉴定出4种免疫分子分型，并通过与欧美患者群比较发现，LMTK3基因在中国人群中表现出早发结直肠癌的特异性突变特征，为深入了解结直肠癌的早期发病机制提供了重要线索。诺禾致源在本次的研究中提供TMT定量蛋白质组学检测技术。

01研究思路

02研究结果

研究团队选取南京结直肠癌队列为研究样本，共纳入了79名结直肠癌患者，其中包括30例早发结直肠癌（EOCRC）患者和49例晚发结直肠癌（LOCRC）患者。所有患者为多组学分析提供了肿瘤组织和正常邻近组织（NATs）样本。研究人员发现，在诊断时，实际年龄与组织中的DNA甲基化年龄（DNAmAge）呈强烈正相关。此外，通过转录组比较分析，EOCRC与LOCRC之间的通路富集分析显示，在前10个显著的KEGG通路中包含与衰老相关的疾病相关的基因。

图1 队列人群多组学研究示意图

接着，研究团队整合了全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES）的数据，总计检测到19,251个体细胞蛋白质改变事件，包括17,442个体细胞单核苷酸变异（SNVs）和1,809个体细胞插入或缺失（indels），涉及到9,815个基因。在整体基因组改变方面，EOCRC肿瘤的肿瘤突变负荷（TMB）显著高于LOCRC肿瘤。此外，在EOCRC肿瘤的突变亚型中，T>G亚型的突变频率较高，而C>A亚型和C>G亚型的突变频率较低。在染色体拷贝数变异方面，研究人员鉴定了11个扩增和7个缺失事件，其中包括已报道的染色体臂扩增和缺失。此外，EOCRC和LOCRC肿瘤之间也显示出显著的染色体拷贝数变异差异。

图2 NJCRC中EOCRC肿瘤的基因组变异

接下来，在表观基因组全局DNA甲基化水平上，研究人员观察到EOCRC肿瘤中CpG岛甲基化表型（CIMP）的高发生率。研究还显示EOCRC肿瘤中DNA甲基化与年龄的相关性显著降低。在转录组数据的分析中，肿瘤免疫微环境（TIME）显示EOCRC肿瘤中存在更高水平的免疫浸润，这可能与免疫老化有关。鉴于肿瘤突变负荷（TMB）和TIME对于免疫疗法有效性的影响，经过分层聚类分析后，研究人员鉴定了四种明显不同的免疫分子分型，在EOCRC中更多地存在“Hot”肿瘤，而这种免疫分子分型与患者的5年生存风险密切相关。

之后，研究人员对肿瘤的分子亚型和基因表达模式进行了研究。尽管在分子亚型共识（CMS）亚组分布方面，EOCRC和LOCRC肿瘤没有显著差异，但发现一些特异于EOCRC的差异表达基因和富集通路。同时，EOCRC和LOCRC蛋白质组分析也揭示了一些与EOCRC特异性相关的下调蛋白和通路，其中包括与长寿调节相关的通路，这与转录组分析的结果相一致。值得一提的是，研究人员发现与临床管理途径相关的一些基因在EOCRC肿瘤中的表达模式存在不一致。 

图3 EOCRC特异的分子事件跨越表观基因组、转录组和蛋白质组水平

经过对EOCRC肿瘤基因突变的研究，发现染色体结构变异（SCNAs）对mRNA和蛋白质丰度具有重要影响。具体而言，SCNAs在mRNA丰度上表现出强烈的顺式效应，而在蛋白质水平上的影响相对较少。此外，研究人员发现染色体20q上存在一个反式SCNA热点，并注意到EOCRC肿瘤中SCNAs对mRNA和蛋白质的影响明显减弱。通过基因级的mRNA-蛋白质相关性分析，发现在转录后调控中，肿瘤内和NATs内的mRNA-蛋白质相关性存在显著差异。针对结直肠癌的潜在治疗靶点，研究人员发现一些在mRNA和蛋白质水平上均表达差异的基因，尤其是CCL21基因在EOCRC肿瘤中表达显著上调。 

图4 EOCRC的整合组学框架及临床治疗学应用

为深入研究早发年龄结直肠癌（EOCRC）与晚发年龄结直肠癌（LOCRC）之间的差异突变基因（DMGs）。研究人员在EOCRC肿瘤中发现了九个DMGs，其中LMTK3和GPR98基因在国际癌症基因组计划（ICGC）中国队列中表现出显著的突变，与欧洲队列相比，并在NJCRC队列中呈现出与TCGA欧洲队列不同的祖源特异性高突变率。进一步研究发现，LMTK3基因突变与肿瘤突变负荷的增加、特定基因签名的改变以及DNA损伤修复相关基因的共同突变有关。

在免疫表型方面，LMTK3突变与CD8+ T细胞和巨噬细胞比例的增加相关，并与热免疫表型的肿瘤有关。此外，LMTK3基因突变还对肿瘤的基因表达水平产生了显著影响，涉及多个与结直肠癌发展和免疫治疗相关的信号通路。

图5 在多组学注释的基础上，EOCRC肿瘤中特异突变的LMTK3基因

为了进一步阐述LMTK3的研究潜力，研究人员发现LMTK3在多数肿瘤中显著上调，尤其在早发年龄结直肠癌（EOCRC）中。无论肿瘤的发病年龄如何，LMTK3的mRNA和蛋白质水平在结直肠癌中都表现为高表达。在正常组织中，LMTK3与PRKCA-AKT1-FOXO3信号通路和ESR1呈显著的相互关联，在肿瘤中这种关联反而减弱，但是LMTK3的突变并未改变PRKCA-AKT1-FOXO3信号通路的基因表达模式。在结直肠肿瘤的单细胞水平上，LMTK3主要表达于上皮细胞中，尤其在EOCRC肿瘤中显著增加，特别是在B细胞和基质细胞中，预示了LMTK3在EOCRC肿瘤的研究重要性。

图6 LMTK3差异表达模式与临床意义

03研究总结

综合所述，本研究通过全面的多组学分析和人群异质性比较，充分解析了中国人群早发性结直肠癌的组学特征，以及肿瘤免疫表型与人群风险评估的生物标志，为探讨早发结直肠癌的致病机理、制定个体化治疗方案以及推动生物标志物研究奠定了坚实基础。

参考文献：

Du M, Gu D, Xin J, et al. Integrated multi-omics approach to distinct molecular characterization and classification of early-onset colorectal cancer[J]. Cell Rep Med,2023;4(3):100974.