1.样本类型

• 样本类型	送样量/样	保存条件	运输条件
  FFPE 组织块	1块	密封后，4℃保存	冰袋运输
  FFPE 切片	2～4张切片（邻片），切片厚度4~6 μm	新切切片，使用官方推荐的粘附性载玻片贴片（具体型号见送样要求）；干燥密封，4℃保存时间＜14天	冰袋运输

2.送样地址

• 收件人：诺禾致源样品组
  电话：18526699037
  邮寄地址：天津市武清开发区创业总部基地B07

3.FFPE蜡块送样要求

• 石蜡包埋块密封后4℃保存，冰袋寄送（蜡块没有年限要求，以质检结果DV200为准）。
  建议组织截面积尽量不要超过所选的芯片捕获框规格，即< 6.5mm*6.5mm 或< 11mm*11mm。
  

4.FFPE切片送样要求

• 4.1 切片要求

  切片厚度4~5 μm；
  根据样本大小，每个样本首先需要切 5-10 张蜡卷（穿刺样本至少 10 张），单独放入离心管中，冰袋寄送至公司进行质检（DV200——长度大于 200bp 的核酸占比）；同时将每个样本贴一张白片（建议使用粘附性载玻片贴片），寄送至公司进行HE染色，找出目的区域，方便后续贴正式文库片，避免贴片超出区域导致重复寄送。
  样本质检合格后，再使用官方推荐的4款粘附性载玻片进行贴片（见表格）

  Slide	Company	Catalog No.
  Epredia™ Shandon™ ColorFrost™ Plus Slides	Fisher Scientific	67-762-14
  Fisherbrand™ Premium Superfrost™ Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
  Poly-L-lysine coated glass slides	Sigma-Aldrich	P0425
  Superfrost® Plus Micro Slide	VWR	48311-703

  
  Notice：根据采购到的粘附性载玻片型号，按照官方标注的位置进行贴片（下图绿色区域内）；由于载玻片无法在仪器中进行旋转，为避免目的区域由于角度无法对齐偏离捕获框，建议贴片时尽量将目的区域与绿色区域边框呈水平状态。
  贴片干燥后，放入载玻片盒，再装入密封袋密封（如条件允许，可以在密封袋中加入干燥剂），冰袋运输。 图7 载玻片贴片区域

• 4.2 送样量

  寄送 2～4张贴片（样本为邻片）。
  Notice：为了避免RNA降解带来的影响，切片需要尽量在14d以内完成正式建库，建议老师切片后尽快寄送。 注意事项
  （1）切片选择：
        包埋块修片前几张切片不用于试验，挑选远离包埋块表面的切片。
  （2）贴片要求：
        使用官方推荐的4款粘附性载玻片进行贴片，组织需位于载玻片中央绿色区域内，超出绿色矩形的组织区域将不能被建库测序；
        部分疑难样本（骨，脂肪，皮肤等）使用粘附性载玻片仍有较高的脱片风险，不代表能顺利执行，需要根据实际情况判定。
        切片、贴片时避免产生划痕和褶皱，谨防后续试验中样本信息获取不完整或脱片；
        贴好FFPE样本的载玻片42摄氏度烤片3h，将载玻片置于载玻片盒，装入密封袋保存（密封袋中可放干燥剂），尽快寄送。
        建议使用新切切片进行贴片。

• 4.3 石蜡块组织包埋方法

  （1）样本预固定处理
  样本来源分类：
  A切除标本（手术活检），在手术时切除整个器官或受累部位——大样本剖开但不切断方式进行充分固定；
  B切口活检标本，从受累部位内取下组织——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  C钻孔活检，通过钻孔取出一小块可疑组织（通常来自皮肤）——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  D刮拭活检，从表面（通常是皮肤）上“刮取”较小的组织碎片——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  E刮宫，从子宫或宫颈的黏膜上刮取小片组织——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  F空芯针穿刺活检，有时使用一根特殊的针穿过皮肤（经皮）取出少量组织样本——根据样本体积直接放入大小合适样本固定袋中；
  B-F类的组织若过于细小，可以用两片浸湿的滤纸，将其夹在中间；
  本步骤中强调：
  ①仔细检查样本信息和随附文件一一对应，所有详细信息均有记录，并可以做到“标本追踪”。
  ②切除后的新鲜组织，为了防止变性或干燥，应尽快固定（样本离体30min内尽快放入10-15倍体积中性缓冲福尔马林固定液中）。标本好越早开始固定，结果越好，并在样本袋外标签处填写详细样本编号等识别信息。
  ③在处理标本之前，应将体积大的样本浸入福尔马林20小时进行固定。
  （2）样本目的部位取材
  涉及对标本进行仔细检查和描述，包括外观、标本块数量及其尺寸。
  A取出预处理的样本，较大的标本需要进一步切开，从目的部位切下2~ 4mm 厚的切片代表性组织块。
  B取出预处理的样本，对于较小的标本，可以处理整个标本，将其直接放在包埋盒（小孔篮）中。 图8 石蜡预处理样本 （3）样本脱水浸蜡
  处理大批量标本时，一般使用“组织处理机”的自动化仪器。这些仪器可以在熔化石蜡加工的一系列不同的溶剂中浸润标本，标本一开始处于水环境中（水基），且必须通过溶剂（通常为乙醇和二甲苯）脱水和清除的多次变化后才能放入熔化的蜡（疏水且不混溶于水）中。
  对特定批次标本选择的“处理时间表”的持续时间和步骤详细信息取决于标本的性质和大小。对于较小的标本，时间表可短至几个小时，对于较大的标本，时间表可长达 12 小时或更长；
  （4）样本石蜡包埋
  将标本从包埋盒中取出并放入蜡填充的模具中。在这个阶段，应仔细定向标本，因为这将决定切割切片的平面，一般以模具底面为目的截面，也就是最终在显微镜下观察的组织截面。
  在组织已处理的包埋盒中带有标本识别详细信息，现在将包埋盒放在模具顶部，并添加更多蜡来将其黏附固定（如图A所示）。现在，标本“块”可在一个冷表面上固化，固定后即可移除模具。包埋盒现在充满了蜡并形成了“块”的一部分，此步骤也为了夹入切片机提供了稳定的底座，将其牢固夹在切片机的标本架中，从块表面切下切片（如图B所示）。
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  图9 A为模具中的样本固定，B为夹在标本架中的样本 （5）注意事项
  ①组织离体时间：组织块离体后应尽快固定，缺血离体时间不宜超过1 h。
  ②组织固定液：推荐10% NBF 或 4% PFA，10% NBF穿透力强，4% PFA穿透力弱一些。
  ③固定时间：根据组织块大小决定，0.5 cm直径组织块一般固定18-24 h，时间不宜过长。
  ④存放条件：蜡块存放环境需保持干燥，可放入干燥器，室温保存。干燥器如下图所示： 图10 干燥器