一、样本类型

二、送样建议

• 1.冷冻OCT包埋组织块送样要求

  密封后，-80℃保存。在OCT包埋盒外注明切割面，干冰运输（OCT包埋块没有年限要求，以质检结果RIN值为准）；
  建议组织截面积 ＜ 35.3 mm × 14.1 mm。
  新鲜或冷冻组织直接进行包埋的操作方法见：附件1：新鲜或冷冻组织OCT包埋方法
  对新鲜组织先进行冷冻保存（暂不包埋）的操作方法见：附件2：新鲜组织冻存操作方法

• 2.FFPE蜡块送样要求

  石蜡包埋块密封后4℃保存，冰袋寄送（蜡块建议一年以内，以质检结果DV200为准）。
  建议组织截面积 ＜ 35.3 mm × 14.1 mm。
  ※ FFPE样本制备方法建议见附件3：石蜡块组织包埋方法。
  
  
  Notice：蜡块必须带有塑料包埋盒，包埋盒可夹固在切片机中用于切片。

• 3.FFPE切片送样要求

  a)RNA质检送样要求

  ① 根据样本大小，每个样本首先需要切5-10张10 μm厚度蜡卷，即总厚度≥50um（穿刺样本至少10张，100um厚），每个样本的蜡卷放入一个单独的1.5mL离心管中，使用封口膜密封后，冰袋干燥寄送至公司进行Angilent 2100质检DV200值（DV200——长度大于200bp的核酸占比）；

  b)成像测试及正式样本要求

  寄送 ≥ 5张贴片（样本为邻片），建议贴片面积 ＜ 35.3 mm × 14.1 mm。
  ※寄送的5张贴片，3张由诺禾致源进行免疫荧光成像质控，1张由诺禾致源进行DSP正式建库测序，1张用于备份。

  切片选择：

  包埋块修片前几张切片不用于试验，挑选远离包埋块表面的切片。
  

  贴片要求：

  （1）使用具有粘附性或带正电荷的防脱载玻片进行贴片，组织需位于载玻片中央（下图绿色矩形区域，最大面积为35.3 mm × 14.1 mm），超出绿色矩形的组织区域将不能被建库测序；
  Notice：防脱载玻片没有品牌限定，可使用常见的世泰牌粘附载玻片（货号：188105W）。部分疑难样本（骨，脂肪，皮肤等）使用粘附性载玻片仍有较高的脱片风险，需要根据实际情况判定。
  
  
  图注：浅蓝色边框为载玻片大小；深蓝色六边形为仪器固定区域；绿色矩形为贴片区域和仪器捕获范围 （2）切片、贴片时避免产生划痕和褶皱，谨防后续试验中样本信息获取不完整或脱片；
  （3）贴好FFPE样本的载玻片42℃烤片3h, 垂直放置，晾干过夜。第二天可将玻片置于载玻片盒，装入密封袋保存（密封袋中可放干燥剂）。
  （4）建议使用新切切片进行贴片。

三、保存及运输

附件1：新鲜或冷冻组织OCT包埋方法

• 2.1所需试剂及耗材

  名称	厂商	货号	备注
  OCT 组织包埋剂	日本樱花SAKURA	PN-4583	湿冰或4℃冰箱预冷≥30min
  组织包埋盒	/	/	包埋盒大小：17*17*5mm
  干冰	/	/	将干冰尽量敲碎
  医用镊子	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  锋利刀片	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  实验用吸水纸	/	/

  Notice：所需试剂耗材，均由客户自行准备

• 2.2 准备工作

  2.1将干冰盒中的干冰尽量敲碎，将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
  2.2将OCT包埋剂放入湿冰中预冷，预冷30min以上，（或可放入4℃冰箱中预冷）
  2.3准备好冷冻组织包埋盒，记号笔标注好样品信息及方向。
  Tips① 使用太小的组织包埋盒，容易使包覆样本的OCT包埋剂过少，可能造成组织裸露，从而影响组织RNA质量。
  
  
  图1 试剂耗材预冷、包埋盒标记

• 3.取样

  3.1 尽量收集新鲜组织样本，避免室温长时间放置，避免污染； 临床样本建议将组织放在干净的离心管或密封袋中，埋入湿冰中短暂保存和运输（小于30 min）。
  3.2 使用实验用吸水纸吸干组织表面血渍或水渍，尽量避免使用PBS或组织清洗液润洗组织，新鲜组织样本截面大小应不超空间转录组检测捕获框检测面积。高度≥1mm，如样本过大，建议在速冻前先将组织分割成多个小块，样本过大可能会导致组织冷冻不均匀。
  Tips① 如组织样本表面较软，不易修剪，可提前将锡箔纸铺到干冰上，将组织放到锡箔纸上进行预冷，表面稍许变硬后再进行修剪；
  Tips② 如样本较薄，可同时制备包埋多份样本，以保证样本足够用于质检、透化和正式实验；
  Tips③ 如样本较厚，需准备高度适宜的包埋盒或将一个包埋盒底部去除，再将另一个包埋盒与其进行叠放，以增加样品包埋高度；
  
  图2 吸水纸组织表面清理、包埋盒底部去除

• 4.包埋

  4.1 将组织包埋盒放到干冰盒内，向包埋模具内注入少量经过湿冰预冷的OCT，注意不要产生气泡。
  4.2 将上述修剪好的组织块或冰冻组织找好角度，水平放置在组织包埋盒中。
  4.3 继续注入 OCT 包埋液直至整个组织块被完全包埋。
  Tips① 自中心点沿时针方向连续轻柔挤出，可有效避免气泡的产生，如产生气泡，可用镊子或细枪头将气泡挑破或向外侧挤出。
  Notice：将所关注的切面平行于包埋盒底部进行包埋，关注的切面朝下放置，我司实验室收到样品后按照平行于包埋盒底部的角度进行切片，如有特殊情况需提前告知。

• 5.速冻

  组织包埋盒继续放置在干冰上并盖上干冰盒盖子，速冻 10min-20min 直至包埋剂变硬变白。
  
  图3 OCT包埋冷冻

• 6.保存

  包埋后的组织固定在包埋盒中，转入自封袋内标记好送样信息即可干冰寄送样本。如暂不送样，则需要将包埋块密封好后放在 -80℃冰箱中冻存。
  Notice： 必须密封储存样本，否则可能会导致组织脱水和损伤。

附件2：新鲜组织冻存操作方法

• 2.1 所需试剂及耗材

  名称	厂商	货号	备注
  异戊烷	Sigma	270342
  液氮	/	/
  干冰	/	/	将干冰尽量敲碎
  液氮及异戊烷容器	/	/	/
  医用镊子	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  锋利刀片	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  实验用吸水纸	/	/

  Notice：所需试剂耗材，均由客户自行准备

• 2.2 准备工作

  2.1 干冰盒中的干冰尽量敲碎，将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
  2.2 将OCT包埋剂放入湿冰中预冷，预冷30min以上，（或可放入4℃冰箱中预冷）。
  2.3 准备金属容器，在金属容器中倒入2/3体积的异戊烷，再将金属器皿放在液氮中，制备成异戊烷液氮浴装置，异戊烷在液氮中预冷10-15min。
  Tips① 异戊烷液氮浴装置中，液氮和异戊烷处于同一水平线；
  Tips② 异戊烷预冷时间长会出现结冰情况，如未满15min即出现结冰现象，则可以缩短预冷时间，当异戊烷结冰时，可将异戊烷从液氮中取出室温放置一小段时间。
  
  图4 异戊烷液氮浴装置

• 3.取样

  取样过程同"一、新鲜或冷冻组织OCT包埋方法"

• 4.冷冻

  4.1 用镊子将组织放入异戊烷，完全浸入液面1min至完全冷冻，冷冻时间根据组织类型和大小而有所不同。
  4.2 冷冻后，迅速将组织转移到提前预冷的低温冷冻管中，并放置在干冰上。
  Notice：请不要直接使用液氮对组织进行速冻，组织表面与液氮的巨大温差会导致液氮在组织表面沸腾，可能会导致气泡空腔或不均匀冷冻，最终影响组织形态。
  图5 低温冻存管保存组织

• 5.保存

  将放入冷冻管内的冷冻组织密封好放入样本存放盒或密封袋中，标记好样本信息，放在 -80℃长期保存。开展实验前，可将冷冻样本取出后按照“一、新鲜或冷冻组织包埋操作方法” 的流程完成样本包埋工作。

附件3：石蜡块组织包埋方法

石蜡切片用组织处理的步骤

• 1. 获取新鲜标本

  新鲜组织标本有各种来源。应当注意的是，在从患者或实验动物身上取下时，它们很容易发生自溶。请务必在取下后尽快小心处理和适当固定。理想情况下，应在切除后，立即固定；如无法立即固定，也应在组织离体后，30分钟以内完成组织固定。

• 2. 固定

  将标本放入10-15倍于组织块体积的液体固定试剂（固定剂）中，推荐10% NBF （中性甲醛缓冲液）或 4% PFA（多聚甲醛）。固定剂将缓慢渗透组织，导致组织变硬，使组织中的核酸和蛋白质发生交联，便于长期保存，也可使组织免受后续处理步骤的影响。理想情况下，标本应保留在固定剂中足够长时间，以让固定剂能够渗透到组织的每个部分，然后再额外保留一段时间让固定化学反应达到平衡（固定时间）。通常，这意味着标本应该固定 6-24 小时（一般4 mm厚度以内的组织固定时间不宜超过24小时，固定时间过长，可能会影响后续基因检出结果）。
  固定后，待处理的标本将放在合适的贴标包埋盒（小孔篮）中，以便将其与其他标本隔离开。
  



• 3. 脱水

  熔化后的石蜡有疏水性（不可与水混溶），因此在浸蜡前，必须去除标本内的大部分水。一般通过将标本浸入一系列浓度渐增的乙醇（酒精）溶液直至达到纯净无水乙醇来进行这个过程。乙醇在所有比例下均可与水混溶，因此，标本中的水逐渐被乙醇替代。使用一系列渐增的浓度来避免组织过度变形。 对于厚度不超过 4mm 的标本，一般的脱水顺序为：（不同大小和类型的组织脱水条件均有不同，建议根据以往的组织类型处理经验调整浓度梯度和处理次数）
  1）70% 乙醇 15 分钟
  2）90% 乙醇 15 分钟
  3）100% 乙醇 15 分钟
  4）100% 乙醇 15 分钟
  5）100% 乙醇 30 分钟
  6）100% 乙醇 45 分钟
  此时，除了微量残留的强结合（分子）水外，应去除标本中所有的水。



• 4. 透明

  虽然组织现在基本上已经没有水分，但组织仍然无法被石蜡浸润，因为石蜡和乙醇很大程度上不混溶。因此，需要使用一种溶剂替换组织中的乙醇（一般选择使用二甲苯），然后二甲苯又能被熔化的石蜡取代。该过程中的这个阶段称为“透明”，选择“透明”一词，是因为许多（并非全部）透明剂会给组织带来透光或透明效果。透明剂的另一个重要作用是去除组织中的大量脂肪，否则脂肪会阻碍浸蜡。
  对于厚度不超过 4 mm 的标本，一般的透明的处理顺序为：
  1）二甲苯 20 分钟
  2）二甲苯 20 分钟
  3）二甲苯 45 分钟



• 5. 浸蜡

  一般选用组织学实验专用石蜡，熔点为55℃~60℃，在此60℃下可浸润到组织中，然后冷却到 20°C，使其凝固。组织学专用石蜡是纯化石蜡和各种添加剂（可能包括树脂，如苯乙烯或聚乙烯）的混合物，具有非常特殊的物理特性，可使经蜡浸润的组织便于切成极薄的切片，并保留充分的弹性，并在温水浴上漂浮过程中完全变平。
  对于厚度不超过 4 mm 的标本，一般的浸蜡处理顺序为：
  1.蜡 30 分钟
  2.蜡 30 分钟
  3.蜡 45 分钟



• 6. 石蜡包埋

  使用包埋模具进行组织包埋，模具内填充有熔化的蜡和标本。在模具中要非常小心地定向标本，因为它的放置方向将决定“切片平面”，这是空间转录组后续实验的重要考虑因素。 将一个包埋盒（小孔蓝）放在模具顶部，加上更多的蜡，将整个组织块放在冷凝板上固化。完成这个操作时，带有附上的包埋盒的组织块可从模具中取出。
  
  

附件4：送样地址