二代DNA文库类型送样建议-诺禾致源

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二代DNA文库类型

1. 动植物重测序
2. 人重测序
- 2.1 组织样本
- 2.2 核酸样本
3. 宏基因组
- 3.1 组织样本
- 3.2 核酸样本
4. 扩增子
- 4.1 组织样本
- 4.2 核酸样本
5. 单菌（真菌、细菌）
- 5.1 组织样本
- 5.2 核酸样本
6. PCR产物
- 6.1 组织样本
- 6.2 核酸样本
7. Chip-seq
- 9.1 核酸样本（IP后）

声明：
诺禾致源拒绝接收《人间传染的病原微生物名录》（点击查看）中危害程度为第一、第二类的高致病组织、血液、细菌等样品，只接收提取得到的核酸样品。危害程度为第三、第四类的致病性或传染性的组织、血液、细菌等样品，必须事先通过销售、客服或运营经理与诺禾致源技术人员联系，确定无高致病性和传染性后才能寄送样品，此时需注意：
1.样品寄送时应采用WHO提出的三级包装系统，第一层容器：装样品，要求防渗漏；第二层容器：要求耐受性好、防渗漏，容纳并保护第一层容器；第三层容器：运输用，最外层包装。
2.在第二层包装注明“致病性样品，接收时请注意”字样，并在样品信息单上注明其危害程度及接收注意事项。此类样品寄送时请第一时间联系销售或运营经理，并务必邮件通知样品组，告知样品组相关寄送信息（快递单号、样品类型、样品数量）以及接收时的防护措施和注意事项。
3.提取风险提示和注意事项：核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系，尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸，请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本，建议自行提取。取样过程中，需要全程佩戴手套，并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒，以免样本污染。

1. 动植物重测序

1.1 植物样本
常规送样
a. 组织样本送样量不低于0.5g，9cm²叶片，建议2g以上，所有植物组织样品均建议离体后立即液氮冻存，然后-80°C保存。
b. 采集样品时应选取核酸含量较多的部位，取幼嫩组织或黄化苗，并在摘取之前黑暗处了3天，在包装前清除灰尘和其他杂物。
c. 植物样品采集时建议用无菌水或75%乙醇擦拭或冲洗干净，再用吸水纸吸干样品表面液体。
d. 样品采集时建议将样品按照一次提取的量进行分管保存，避免提取时由于二次分管和并管引起样品降解。
e. 锡箔纸包装的组织样品，折叠时需有纹理可循，避免打开锡箔纸时样品洒落。
f. 优先选用新鲜采集的样品送样，其次才是冻存的样品。
特殊植物物种送样建议
特殊情况：藻类生长环境的特殊性导致藻类样本易存在污染，因此在藻类样本准备的时候需要额外注意，否则会影响数据的产出。
样本处理：连续使用多种抗生素处理培养（强烈推荐）；野外样本使用无菌水多次清洗（不推荐，送样需要提前说明）。
例：圆柱拟脆杆藻样本
准备：多为细菌污染，由氨苄青霉素(50μg/mL)和氯霉素(1μg/mL)连续培养3天。
1.2 动物样本
常规送样
a. 送样量不低于0.3g，最好1g以上，组织、细胞样本获取后，若有血渍、培养基等残余物，需用无菌水或PBS缓冲液清洗干净，擦干后液氮速冻，-80℃长期保存，干冰运输。
b. 单只低于50mg的昆虫样本建议多只送样。
c. 用一次性注射器采集静脉血1~2mL，动物血液哺乳类送样量不低于1mL，红细胞有核类送样量不低于0.5mL，建议采用EDTA抗凝的采血管收集样品，轻轻振荡使其与抗凝剂充分混匀，液氮速冻，-80℃保存，保存期限不超过2个月或者-85℃保存,保存期限不超过3个月，干冰运输。
d. 细胞送样量>5*10⁶，优先选用新鲜采集的样品送样，其次才是冻存的样品。采集样品时应选取核酸含量较多的部位（如动物的肝脏组织）。
e. 毛发样本>20根，必须含有毛囊。
特殊动物物种送样建议
1. 虫类（昆虫、寄生虫等）
特殊情况：昆虫&寄生虫污染较为严重。
a. 饥饿处理：根据物种饥饿耐受情况，饥饿6-48h；
b. 表面消毒：75%乙醇浸泡1-2min，无菌水漂洗1-2次，滤纸吸干后速冻；
c. 喂食抗生素：昆虫--尽量使用广谱抗生素或者近缘物种报道过的无菌品系构建所使用的抗生素种类、浓度，处理天数2-5d，可视物种情况而定；寄生虫-寄主喂食高浓度抗生素，寄生虫取食血液2-5d；
d. 去除肠道或整个腹部，保留胸部、头部提取。
2. 水产类：甲壳动物（虾类和蟹类等），软体动物（海绵和海参等），刺胞动物（珊瑚等）
a. 尽量保证新鲜个体；
b. 尽量避免寄送保存时间较长或经过反复冻融的组织样品；
c. 针对软体动物可先使用75%的乙醇进行漂洗，漂洗干净后液氮冷冻，干冰运输；
d. 刺胞动物，可去除头部和肠道等部位，保留肌肉外壁用于提取。

1.3 核酸样本

文库类型	浓度	体积	总量	备注
DNA 小片段文库	>5ng/μl	20μl≤V≤120μl	>400ng	针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况,需要过柱纯化后送样或者酌情增加送样量

2. 人重测序

2.1 组织样本
a. 新鲜组织：黄豆大小1～2粒，液氮速冻后，-80℃保存（可以保存在RNALater中，切记不要保存在TRIzol中）
b. 血液：≥1mL，EDTA抗凝管（紫色盖子）或加EDTA/柠檬酸钠抗凝剂，-80℃保存，避免反复冻融（抗凝剂不能用肝素/肝素钠）
c. 细胞系：≥5*10⁷个细胞；加细胞冻存液（血清+10%DMSO），液氮慢冻/收集得到细胞沉淀，液氮速冻
d. 提取cf/ctDNA：血浆：≥4mL；血清：≥5mL；脑脊液样本：≥4mL；分装于1.5mL无核酸酶离心管中，-80℃保存；客户自提cfDNA：总量>30ng，体积>10μL，干冰运输。
【注】公司不接收全血样本提取cfDNA，溶血样品不能纳入试验选样，存放周期超过1年的血浆（清）样本不建议送样提取；脑部肿瘤由于血脑屏障的存在，血浆不适合进行cfDNA研究，一般推荐取脑脊液样本提取cfDNA
e. FFPE贴片/卷片：厚度在5-10μm,含组织面积大于25mm²的切片6张，尽量保证组织中恶性肿瘤细胞所占比例较大，至少超过60%，贴片取样会有损失,建议送样量加倍
f. 石蜡块：组织体积>1.5cm³
g. 唾液：≥4mL，清水漱口1~2次，然后吐掉，漱口后等候至少5分钟方可采集唾液，在30分钟内采集4mL唾液（不含泡沫），等体积保存液倒在采集管中，充分颠倒混匀，常温保存
h. 毛发：>20根，毛发必须含有毛囊
i. 拭子：>4个
【注】样本制备时，口腔内壁需多摩擦一会，尽量取到多的口腔细胞。

2.2 核酸样本

文库类型	浓度	体积	总量	备注
人外显子、目标区域捕获	>13ng/μl	20μl≤V≤120μl	>500ng	针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况,需要过柱纯化后送样或者酌情增加送样量
DNA小片段文库	>5ng/μL	20μL≤V≤120μL	>400ng	针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况,需要过柱纯化后送样或者酌情增加送样量

3. 宏基因组

3.1 组织样本
a. 土壤／污泥／沉积物／腐殖质：≥5ml（离心管刻度）或≥3g；建议使用5mlEP或15ml、50ml离心管进行装载，并用封口膜封口，使用自封袋容易撒漏导致样品交叉污染
b. 粪便、肠道内容物≥2mL、食糜≥4mL（离心管刻度）或≥2g；粪便样本不建议保护液寄送，直接寄送粪便提取效果更好；拭子建议用保护液
c. 瘤胃液／发酵液／组织液／冲洗液（离心有明显沉淀)3-5ml或沉淀≥1 g
d. 水体、空气滤膜：直径4cm，滤膜3张（有明显颜色沉淀在滤膜上)
e. 拭子：5-10个;无菌拭子反复擦拭，拭子表面有肉眼可见变化，对于较干燥的表面，可用生理盐水浸湿拭子后擦拭，以采取更多的微生物

3.2 核酸样本

文库类型	浓度	体积	总量	备注
宏基因组文库	>5ng/μl	20μl≤V≤120μl	>400ng	针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况,需要过柱纯化后送样或者酌情增加送样量

4. 扩增子

4.1 组织样本
a. 植物组织>0.5g，成熟组织部位,例如植物根、茎、种子等部位建议2倍以上送样
b. 动物组织>0.3g，核酸不丰富部位,例如脂肪、成熟皮肤、骨头等部位建议增加送样量
c. 动物血液(哺乳类)>1mL；动物血液(红细胞有核类)> 0.5mL，血清血浆需酌情增加送样量
d. 唾液>4mL
e. 菌液(对数生长期)>4mL；菌体≥4mL菌液离心；真菌菌丝>0.5g
f. 土壤>2mL（离心管刻度）
g. 粪便、肠道内容物、食糜≥1mL（离心管刻度）；瘤胃液>2mL
胃液有浑浊,离心送沉淀为佳
h. 水体(滤膜)：直径4cm，滤膜3张，如果菌群丰度较低，建议增加送样量
i. 拭子>4个，拭子表面有明显颜色变化，达到富集微生物的目的

4.2 核酸样本

文库类型	浓度	体积	总量	备注
DNA 小片段文库	>4ng/μl	50μl≤V≤120μl	>150ng	针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况,需要过柱纯化后送样或者酌情增加送样量

5. 单菌（真菌、细菌）

5.1 组织样本
a. 样本量：菌体≥2g，-80℃保存，干冰寄送
b. 样本准备：对数期4ml菌液，4000×g离心10min（4℃），弃上清，沉淀（对应菌液离心）用无菌水洗2次后干冰送样，建议送2-3个平行，避免一次提取不成功
c. 甘油保存的样本，需要重新液体培养基（例如 LB）活化到对数期，不可直接送甘油保存的菌株
d. 不建议送固体培养皿的菌，如是只有固体培养基才能活，可以刮到有PB缓冲液的离心管里面，离心，送沉淀2g以上
e. 真菌（＞0.5g）大型菇类等，建议送菌丝，不建议送孢子或是子实体，杂合率较高，不利于组装
f. 样本一定为非灭活样本，灭活会导致核酸严重降解
g. 不接中国传染病原微生物名录里涉及的菌种样本中国传染病原微生物名录
【注】细菌和真菌DNA样本，请老师首先进行污染排查检测和物种鉴定，污染排查和物种鉴定方法：细菌可以扩增16s全长后送一代测序，真菌还需扩增ITS全长，确定物种正确，无其他杂菌污染再送样
霉菌和蕈菌可能存在二倍体杂合度比较高的情况，而且也可能包含其他杂菌，如果直接提取DNA送样，会影响后续染色体组装效果，建议先进行纯化培养，多传几代，可以取孢子分离纯培养，然后再提取DNA送样

5.2 核酸样本

文库类型	浓度	体积	总量	备注
DNA 小片段文库	>5ng/μl	20μl≤V≤120μl	>400ng	针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况,需要过柱纯化后送样或者酌情增加送样量

6. PCR产物

6.1 组织样本

样本类型	PCR-free文库 350bp (基因组)	PCR-free文库非350bp （基因组）
植物组织	>3g	>3g
动物组织	>1.5g	>1.5g
细胞	>8*10⁸个	>>8*10⁸个
动物血液(哺乳类)	>5mL	>5mL
动物血液(红细胞有核类)	>3mL	>3mL
唾液	>10mL	>10mL
菌液(对数生长期)	>5mL	>5mL
土壤	3mL	3mL
粪便、肠道内容物、食糜	>2mL	>2mL
瘤胃液	>2mL	>2mL
水体(滤膜)	直径4cm滤膜3张	直径4cm滤膜3张
拭子	>10个	>10个

6.2 核酸样本

a.PCR产物要经过纯化（如胶回收纯化），确保条带单一，无降解，无引物二聚体
b.送样时使用干冰或冰袋运送
c.PCR产物构建pcr-free文库时，PCR产物不可以加illumina测序接头（P5、P7序列、搭桥序列）

文库类型	浓度	体积	总量	备注
扩增子（pcr产物单建库）	-	20μl≤V≤120μl	>1500ng	针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况,需要过柱纯化后送样或者酌情增加送样量
PCR-free文库 350bp	>24ng/μL	20μl≤V≤120μl	>2μg
PCR-free文库非350bp	>24ng/μL	20μl≤V≤120μl	>5μg

7. Chip-seq

7.1 核酸样本（IP后）

浓度	体积	总量
>2ng/μl	20μl≤V≤120μl	>30ng