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送样建议

质谱流式

声明:
实验室不接收《人间传染的病原微生物名录》(点击查看)的所有样品。对于高毒性动植物等样品,必须事先通过销售、客服或运营经理与诺禾致源技术人员联系,确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
提取风险提示和注意事项:核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系,尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响,因此较难保证单次提取满足质量要求,客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸,请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本,建议自行提取。取样过程中,需要全程佩戴手套,并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒,以免样本污染

1. 质谱流式样本制备流程

2. 寄送样本类型

制备 可接收样本类型 送样量/样 储存条件 运输条件 备注
公司 新鲜组织 黄豆粒大小 组织保存液 4度
48h内到达)
 
新鲜细胞悬液类
(全血、原代细胞等)
全血:5ml
细胞:1*107
全血:抗凝管
原代细胞:培养基
室温
2h内到达)
 
客户 细胞培养物 1*107 细胞冻存液
梯度冻存
干冰 公司可提供标记固定服务
PBMCs 1*107 细胞冻存液
梯度冻存
干冰 公司可提供标记固定服务
裂红全血 1*106 细胞冻存液
梯度冻存
干冰 必须进行顺铂标记和多聚甲醛固定,不可直接冻存
组织单细胞悬液 1*106 细胞冻存液
梯度冻存
干冰 必须进行顺铂标记和多聚甲醛固定,不可直接冻存
注:
1.为了保证细胞活性,细胞计数后会直接进行顺铂标记固定,如需要备份出一定量未标记固定细胞,则需要邮寄前备注:需要备份+备份量
2.为保证下机数据质量,送样量为推荐最低送样量,制备后低于样本要求(总细胞数10*6,活性70%)为风险上机,需再确认是否执行
3.单细胞悬液在后续标记固定中会有细胞损失,因此建议送样细胞量为107及以上,以保证单样本上机细胞数达标
4. 临床病人如果进行过加强 CT、血管造影、栓塞等与重金属相关的检查或治疗,则不可进行质谱流式实验。未提前告知和沟通的情况下,实验结果不佳或仪器损坏的后果须由客户承担
5.组织样本的检测结果可能会有不符合预期的情况出现,建议额外送一个PBMCs或脾细胞作为阳性对照
6.单细胞悬液质量很大程度取决于组织类型和疾病状态,离体、病变、凋亡、用药等均可能影响细胞活性,因此无法对消化后的细胞活性进行承诺
7.其他样本类型评估请联系诺禾致源质谱事业部产品市场部

3. 寄送样本要求

  • 3.1 新鲜组织样本

    1)在4h内使用PBS对获得的组织(黄豆粒大小以上,直径4-5mm)进行清洗,将血液残留洗净(冰上操作),若为肠道组织需清除肠内容物;然后将样本转移至装有预冷组织保存液的离心管中,样本必须完全被组织保存液浸没,将离心管用封口膜封好,避免气泡,防止与空气长时间接触。整个操作过程尽量无菌操作。
    (一般1ml组织保存液即可浸没,需选用合适大小的离心管,防止运输中样本与空气接触)
    注:内源酶含量高的功能脏器容易降解(例如:胰腺 脾脏、肠道、肺),建议客户尽可能多收集样本。
    2)如样本量足够建议首次寄送时同一样本2-3管重复,以防万一。
    3)客户需标明:样本名称,组织类型,离体时间,浸入组织保存液时间。
    4)寄送时装有样本的储存管不能和冰袋直接接触,需用泡沫包裹,保证 4℃左右的低温环境。
    5)冰袋寄送(注意不要选择干冰),务必保证在48小时内到达天津实验室。(若普通物流无法48h内到达,客户可选择冷链运输)
    6)为了提前确定合适的实验条件,送样时建议备注样本类型,例如:肿瘤,炎症,xx条件造模组等。
    特殊样本注意事项:
    胰腺:胰腺癌组织属于普通样本, 癌旁(正常)组织属于困难样本(正常胰腺中有大量的RNA酶,使用抑制剂效果也有限,一般建议是离体后立刻放入保存液,并在6小时内处理完毕)
    骨:软骨属于普通样本,硬骨、椎间盘等钙化程度高的骨类样本,因活细胞占比低,属于困难样本
    血管:属于正常样本,但细胞得率较低,对样本量有较大要求,需要正常样本的三倍,约0.6g-1g,花生粒大小,尽量多送
    脑脊液:属于简单样本,但经常性会出现细胞量过少的情况,主要原因为正常的脑脊液中细胞本身含量少
    组织保存液原理及储存:(推荐:美天旎MACS®组织保存液  货号:130-100-008)
    组织保存液中含有低温状态下稳定细胞状态的关键离子以及pH缓冲液、能量代谢底物、自由基清除剂、渗透/吸胀稳定剂。
    储存条件:2~8℃ 避光保存,切勿冻存
  • 3.2 新鲜细胞悬液(推荐<2h)

    1)全血样本:推荐用肝素或者柠檬酸盐做为抗凝剂,EDTA抗凝的PBMCs样本后续需要额外的洗涤步骤。一般情况下,推荐在2小时内将全血样本需要送达实验室,常温运输(22摄氏度最佳,不要低于15度或者高于35度)
    2)原代细胞:使用50mL离心管,注满培养基后常温运输。
  • 3.3 细胞培养物

    1)镜检细胞状态良好,生长密度达 80%
    2)悬浮培养细胞、使用胰酶消化的贴壁细胞单细胞悬液离心(300-500g,5 分钟,4℃),去上清,依照下文中的“顺铂标记及细胞固定”方法进行后续处理
    3)若需公司进行标记固定操作,则需梯度冻存细胞,按照 2×106 ~1×107/mL 将细胞用冻存液重悬混匀(细胞冻存液:90%FBS+10%DMSO 现配现用或市售细胞冻存液),分装至冻存管中(细胞冻存请使用专用的细胞冻存管),每个冻存管不少于 500μL 细胞悬液。
    4)短期可储存于-80℃冰箱(1月内),长期保存置于液氮罐,寄送全程用干冰运输,干冰量需充足。
  • 3.4 全血分离的的PBMCs

    推荐使用肝素、柠檬酸钠抗凝管,在离体4h内使用Ficoll或者Percol对全血进行密度梯度离心分离出PBMCs。
    1)用生理盐水/PBS将全血样本1:1稀释;
    2)在15mL离心管中加入1倍体积的Ficoll淋巴细胞分离液;将离心管倾斜,用一次性吸管缓缓的将稀释后的全血加入Ficoll上,注意不要晃动,以免扰动液面影响分层;
    3)常温400g,离心20min;
    4)吸出中层白色的PBMCs细胞,尽量不要吸到上层的血浆,转移至新的15ml离心管中。
    5)加入预热的无血清DMEM/1640,室温下300g,5 min离心细胞悬液。
    6)用移液器小心吸去上清。
    7)如果红细胞太多,需用红细胞裂解液处理样本。
    8)估计细胞数量,用1ml预热的无血清的DMEM/1640重悬细胞沉淀。依照下文中的“顺铂标记及细胞固定”方法进行后续处理。
    9)若需公司进行标记固定操作,则需梯度冻存细胞,重悬细胞后离心(300-500g,5分钟,4℃),去上清,按照2×106 ~1×107/mL将细胞用冻存液重悬混匀(细胞冻存液:90%FBS+10%DMSO 现配现用或市售细胞冻存液),分装至冻存管中(细胞冻存请使用专用的细胞冻存管),每个冻存管不少于 500μL 细胞悬液。
    10)短期可储存于-80℃冰箱(1月内),长期保存置于液氮罐,寄送全程用干冰运输,干冰量需充足。
    注意:血清或其他蛋白成分会影响顺铂染色,请用不含血清的培养基;如果需要进行细胞刺激,请将培养基预热。
  • 细胞梯度冻存操作

    方法一:细胞程序冻存盒(推荐异丙醇冻存盒)
        1)将冻存盒恢复至室温
        2)用配置好的细胞冻存液重悬细胞后分装到冻存管中,拧好管盖,封口膜封管,做好标记
        3)冻存管放入冻存盒,冻存盒放入-80℃冰箱
        4)24h后冻存管从冻存盒取出,转移至液氮长期保存
    方法二:手动梯度降温
        1)用配置好的细胞冻存液重悬细胞后分装到冻存管中,拧好管盖,封口膜封管,做好标记
        2)冻存管按照【4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(24h)→液氮】的顺序放置

4. 顺铂标记及细胞固定操作

该部分用于客户制备单细胞悬液后的操作,顺铂标记及细胞固定后即可冻存。(需要梯度降温,短期冻存于-80,长期冻存于液氮罐中,干冰寄送)
  • 4.1 试剂准备

    名称 储存条件 备注
    顺铂(Cisplatin) -20℃ 公司邮寄,每管5ul浓度5mM稀释5000倍使用(稀释后工作液浓度1uM每管可用于50个样本标记)
    FIX1 常温 Fludigm,货号 201065,可用 1.6%的多聚甲醛(PFA)代替
    细胞染色缓冲液 (Cell Staining Buffer) 4℃ Fludigm, 货号 201068,可用含有 5% FBS 的 PBS 代替
    细胞冻存液(固定后) 现配现用 10%DMSO+90%细胞染色缓冲液(Cell Staining Buffer)
    PBS 常温
    注:
    1)固定后使用的细胞冻存液为10%DMSO+90%细胞染色缓冲液,区别于活细胞冻存液。细胞染色缓冲液用于后续细胞表面染色和清洗步骤,可减少抗体对目的细胞的非特异性结合。
    2)配制顺铂工作液及顺铂染色操作,务必佩戴手套。
  • 4.2 顺铂染色

    1、取处理得到的新鲜单细胞悬液,1-3×106 细胞加入 1 mL PBS 重悬,300 g、5 min 离心去上清
    2、加入500ul顺铂工作液至细胞悬液中,充分混匀
    3、室温下孵育 2 min
    4、取出细胞悬液,加入1.5ml常温的 Cell Staining Buffer,混匀中止标记反应
    5、常温 300g离心 5 min
    6、加入 1mL 常温的 Cell Staining Buffer 重悬细胞
    附:顺铂染色原理: 短时间的处理过程中,顺铂无法进入活细胞内部,因此信号很弱。死细胞内大量蛋白与顺铂共价结合,会呈现较强的信号。以此来区分死活细胞。
  • 4.3 细胞固定及冻存

    1、顺铂染色步骤结束后,加入500ul Fix1(需要稀释到 1×)混匀(或1.6%的多聚甲醛),立即用移液器上下吹打,并涡旋振荡混匀,以减少细胞形成二聚体,室温下孵育 10 min
    2、加入2ml Cell Staining Buffer , 混匀取少量细胞进行计数
    3、4℃,600 g,离心 5 min,吸弃上清
    4、根据计数结果调整冻存液体积,密度调至2×106 ~1×107/mL,将细胞用冻存液重悬混匀(细胞冻存液(固定后):现配现用 10%DMSO+90%细胞染色缓冲液)
    5、将样品保存到-80℃冰箱,24h后转移至液氮罐中。

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