一、支持样本类型

1.FFPE石蜡块
2.FFPE切片
3. 冷冻OCT包埋组织块（Fresh Frozen, FF）

二、送样建议

• 样本类型	送样量/样	保存条件	运输条件
  FFPE 蜡块	1块	密封后，4℃保存	冰袋运输
  FFPE 切片	质检样本：50um总厚度以上的石蜡卷（穿刺样本100um） 正式样本：2～4张切片（邻片），切片厚度4~6 μm	质检样本：1.5ml EP管干燥密封，4℃保存 正式样本：新切的切片，使用官方推荐的粘附性载玻片贴片（具体型号见送样要求）；干燥密封，4℃保存时间＜30天（切片至建库间隔时间）	冰袋运输
  OCT包埋块	样本厚度大于1mm，面积小于6.5*6.5mm或< 11mm*11mm。	-80℃冰箱保存，包埋盒外标注切割面	干冰运输

  1.FFPE蜡块送样要求

  石蜡包埋块密封后4℃保存，冰袋寄送（蜡块建议一年以内，以质检结果DV200为准）。 建议组织截面积尽量不要超过所选的芯片捕获框规格，即< 6.5mm*6.5mm 或< 11mm*11mm。 ※ FFPE样本制备方法建议见附件1：石蜡块组织包埋方法。

Notice：蜡块必须带有塑料包埋盒，包埋盒可夹固在切片机中用于切片。

2.FFPE切片送样要求

• 1）RNA质检送样要求

  ① 根据样本大小，每个样本首先需要切5-10张10 μm厚度蜡卷，即总厚度≥50um（穿刺样本至少10张，100um厚），每个样本的蜡卷放入一个单独的1.5mL离心管中，使用封口膜密封后，冰袋干燥寄送至公司进行Angilent 2100质检DV200值（DV200——长度大于200bp的核酸占比）；
  ② 同时将每个样本贴一张白片（建议使用粘附性载玻片贴片，切片厚度5μm，选取正式切片的相邻切片, 42℃烤片3h），寄送至公司进行H&E染色，找出目的区域，如您在实验室已经自行切片染色，确认后续正式样本中存在感兴趣的目标区域，可无需寄送白片。
  Notice：质检样本量过少，可能导致质检结果假阴性

  2）正式建库样本送样要求

  ①正式建库样本建议使用官方推荐的4款粘附性载玻片 (正电荷吸附玻片) 进行贴片（见表格），组织需位于载玻片中央绿色区域内，超出绿色矩形的组织区域将不能被建库测序；

  Slide	Company	Catalog No.
  Epredia™ Shandon™ ColorFrost™ Plus Slides	Fisher Scientific	67-762-14
  Fisherbrand™ Premium Superfrost™ Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
  Poly-L-lysine coated glass slides	Sigma-Aldrich	P0425
  Superfrost® Plus Micro Slide	VWR	48311-703
  世泰CITOTEST 超白玻璃 粘附载玻片（诺禾自用国产测试）	江苏世泰	188105w

  
  
  

  Notice：

  1.根据您的粘附性载玻片型号，按照官方标注的位置进行贴片（标签端尺寸不同或是否有+号，绿色区域范围略有不同） 2.部分疑难样本（骨，脂肪，皮肤等）使用粘附性载玻片仍有较高的脱片风险，不代表能顺利执行，需要根据实际情况判定。
  3.注意玻片规格: 长*宽*厚为 75mm*25mm*1mm
  4.Visium CytAssist都需通过CytAssist仪器进行切片对齐，探针转移操作，如下图所示，仪器上盖可固定粘附有组织的防脱玻片，机舱内固定有Visium检测芯片。在进行探针转移时，仪器上盖的玻片可与Visium检测芯片的捕获区域进行垂直对齐。由于载玻片无法在仪器中进行大幅度的旋转，为避免目的区域由于角度无法对齐偏离捕获框，建议贴片时尽量将目的区域与绿色区域边框呈水平状态。
  
建库圈选的捕获区域只能为水平，关注的区域应保证水平框选能够被完全框入
• 5.关注的组织区域应小于6.5mm*6.5mm或11mm*11mm（visium cytassist 11mm版本），如果贴片的实际组织比捕获区域大，样本邮寄至公司实验室后，实验室将对普通玻片上的组织进行 H&E 染色，此时将图片发送给客户，由客户快速选择组织上6.5mm*6.5mm(11*11mm）的感兴趣区域，后续实验在 CytAssist 仪器中将此区域与基因表达芯片捕获框对应，同时建议客户提前对所寄送的样本进行预染色，充分了解样本情况。 ② 正式建库时，每个样本寄送2-4张贴片（1张为正式建库样本，其余为备份样本），切片厚度5μm（样本为邻片）,水浴展片后捞片贴片，42度烤片3h。如没有烤片条件，送样时需备注，样本未经过烤片。

  NOTICE:

  1.包埋块修片前几张切片不用于试验，挑选远离包埋块表面的切片。
  2.为了避免RNA降解带来的影响，建议老师切片后尽快寄送。
  3.切片、贴片时避免产生划痕和褶皱，谨防后续试验中样本信息获取不完整或脱片；
  4.建议使用新切切片进行贴片。4度干燥保存时间不要超过30天
  ③ Visium CytAssit由于捕获框较小，均不建议拼片操作，如果您的组织较小，有充分利用芯片的必要需求，建议您通过以下两种方法制备（分别为包埋块拼样和石蜡切片拼样）；
  石蜡包埋时，将组织包埋于同一石蜡包埋块内，此时需注意关注的切面应处于同一水平面，两个组织中间间距建议1mm以上，同时两个组织相距的最远端距离≤6.5mm(11mm)；
  通过石蜡切片拼样时，样本准备原则应符合FFPE切片送样要求中的所有要求，此时可将两个（不建议超过3个）组织切片小心的按顺序捞片贴片于防脱玻片的绿色区域，两个组织中间间距建议1mm以上，同时两个组织相距的最远端距离≤6.5mm(11mm)，组织不可出现重叠覆盖，如下图所示；

3.冷冻OCT包埋组织块送样要求

冷冻OCT包埋组织块-80℃密封保存，干冰运输寄送（以质检结果RIN≥4为合格标准）。 建议组织截面积尽量不要超过所选的芯片捕获框规格，即< 6.5mm*6.5mm或 11mm*11mm(Visium CytAssist版本)

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新鲜或冷冻组织直接进行包埋的操作方法见：附件1：新鲜或冷冻组织OCT包埋方法
对新鲜组织先进行冷冻保存（暂不包埋）的操作方法见：附件2：新鲜组织冻存操作方法

三、保存及运输

1.石蜡组织块应干燥密封保存在4℃环境中，样本邮寄时应在运输包装内放置足量的填充物，防止运输过程中蜡块剧烈碰撞，发生组织碎裂。同时需在外包装内放置足量冰袋，保持4℃环境运输。
2.切片应放置于切片盒内，干燥环境下4℃密封保存，冰袋邮寄。切片盒盖子需要用封口膜缠紧；

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3.冷冻OCT包埋块样品从-80℃冻存环境中取出，放入壁厚且质量完好的泡沫盒中，样品的四周都需用干冰填满，将泡沫盒密封好后邮寄至诺禾致源样本组。24 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 5kg；48 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 10kg；72 小时内能够到达的，干冰重量不得低于 15kg。

附件1：新鲜或冷冻组织OCT包埋方法

• 2.1 所需试剂及耗材

  名称	厂商	货号	备注
  OCT 组织包埋剂	日本樱花SAKURA	PN-4583	湿冰或4℃冰箱预冷≥30min
  组织包埋盒	/	/	包埋盒大小：17*17*5mm
  干冰	/	/	将干冰尽量敲碎
  医用镊子	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  锋利刀片	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  实验用吸水纸	/	/

  Notice：所需试剂耗材，均由客户自行准备

2.2 准备工作

2.1 将干冰盒中的干冰尽量敲碎，将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
2.2 将OCT包埋剂放入湿冰中预冷，预冷30min以上，（或可放入4℃冰箱中预冷）
2.3 准备好冷冻组织包埋盒，记号笔标注好样品信息及方向。
Tips① 使用太小的组织包埋盒，容易使包覆样本的OCT包埋剂过少，可能造成组织裸露，从而影响组织RNA质量。

图1 试剂耗材预冷、包埋盒标记

3.取样

3.1 尽量收集新鲜组织样本，避免室温长时间放置，避免污染； 临床样本建议将组织放在干净的离心管或密封袋中，埋入湿冰中短暂保存和运输（小于30 min）。
3.2 使用实验用吸水纸吸干组织表面血渍或水渍，尽量避免使用PBS或组织清洗液润洗组织，新鲜组织样本截面大小应不超空间转录组检测捕获框检测面积。高度≥1mm，如样本过大，建议在速冻前先将组织分割成多个小块，样本过大可能会导致组织冷冻不均匀。
Tips① 如组织样本表面较软，不易修剪，可提前将锡箔纸铺到干冰上，将组织放到锡箔纸上进行预冷，表面稍许变硬后再进行修剪；
Tips② 如样本较薄，可同时制备包埋多份样本，以保证样本足够用于质检、透化和正式实验；
Tips③ 如样本较厚，需准备高度适宜的包埋盒或将一个包埋盒底部去除，再将另一个包埋盒与其进行叠放，以增加样品包埋高度；

图2 吸水纸组织表面清理、包埋盒底部去除

4.包埋

4.1 将组织包埋盒放到干冰盒内，向包埋模具内注入少量经过湿冰预冷的OCT，注意不要产生气泡。
4.2 将上述修剪好的组织块或冰冻组织找好角度，水平放置在组织包埋盒中。
4.3 继续注入 OCT 包埋液直至整个组织块被完全包埋。
Tips① 自中心点沿时针方向连续轻柔挤出，可有效避免气泡的产生，如产生气泡，可用镊子或细枪头将气泡挑破或向外侧挤出。
Notice： 将所关注的切面平行于包埋盒底部进行包埋，关注的切面朝下放置，我司实验室收到样品后按照平行于包埋盒底部的角度进行切片，如有特殊情况需提前告知。

5.速冻

组织包埋盒继续放置在干冰上并盖上干冰盒盖子，速冻 10min-20min 直至包埋剂变硬变白。

图3 OCT包埋冷冻

6.保存

包埋后的组织固定在包埋盒中，转入自封袋内标记好送样信息即可干冰寄送样本。如暂不送样，则需要将包埋块密封好后放在 -80℃冰箱中冻存。
Notice： 必须密封储存样本，否则可能会导致组织脱水和损伤。

附件2：新鲜组织冻存操作方法

• 1. 所需试剂及耗材

  名称	厂商	货号	备注
  异戊烷	Sigma	270342
  液氮	/	/
  干冰	/	/	将干冰尽量敲碎
  液氮及异戊烷容器	/	/	/
  医用镊子	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  锋利刀片	/	/	使用前干冰预冷≥30min
  实验用吸水纸	/	/

  Notice：所需试剂耗材，均由客户自行准备

• 2.准备工作

  2.1 干冰盒中的干冰尽量敲碎，将镊子、刀片等工具放置在干冰上预冷30min以上。
  2.2 将OCT包埋剂放入湿冰中预冷，预冷30min以上，（或可放入4℃冰箱中预冷）。
  2.3 准备金属容器，在金属容器中倒入2/3 体积的异戊烷，再将金属器皿放在液氮中，制备成异戊烷液氮浴装置，异戊烷在液氮中预冷 10-15min。
  Tips① 异戊烷液氮浴装置中，液氮和异戊烷处于同一水平线；
  Tips② 异戊烷预冷时间长会出现结冰情况，如未满15min即出现结冰现象，则可以缩短预冷时间，当异戊烷结冰时，可将异戊烷从液氮中取出室温放置一小段时间。
  
  图4 异戊烷液氮浴装置

• 3.取样

  取样过程同“一、新鲜或冷冻组织OCT包埋方法“

• 4.冷冻

  4.1 用镊子将组织放入异戊烷，完全浸入液面1min至完全冷冻，冷冻时间根据组织类型和大小而有所不同。
  4.2 冷冻后，迅速将组织转移到提前预冷的低温冷冻管中，并放置在干冰上。
  Notice：请不要直接使用液氮对组织进行速冻，组织表面与液氮的巨大温差会导致液氮在组织表面沸腾，可能会导致气泡空腔或不均匀冷冻，最终影响组织形态。
  图5 低温冻存管保存组织

• 5.保存

  将放入冷冻管内的冷冻组织密封好放入样本存放盒或密封袋中，标记好样本信息，放在 -80℃长期保存。开展实验前，可将冷冻样本取出后按照“一、新鲜或冷冻组织包埋操作方法” 的流程完成样本包埋工作。

附件3：石蜡块组织包埋方法

组织处理可以手动进行（手工处理），但如果必须处理多个标本，则使用自动组织处理机会更方便、更高效。
这类处理机有两种主要类型：浸泡式机器，可在容器间转移标本来处理，适用于小型实验室;
封闭式组织处理仪，可将标本固定在单处理室或脱水缸中，并按需泵入和泵出流体。

石蜡切片用组织处理的步骤

• 1. 获取新鲜标本

  新鲜组织标本有各种来源。应当注意的是，在从患者或实验动物身上取下时，它们很容易发生自溶。请务必在取下后尽快小心处理和适当固定。理想情况下，应在切除后，立即固定；如无法立即固定，也应在组织离体后，30分钟以内完成组织固定。

• 2. 固定

  将标本放入10-15倍于组织块体积的液体固定试剂（固定剂）中，推荐10% NBF （中性甲醛缓冲液）或 4% PFA（多聚甲醛）。固定剂将缓慢渗透组织，导致组织变硬，使组织中的核酸和蛋白质发生交联，便于长期保存，也可使组织免受后续处理步骤的影响。理想情况下，标本应保留在固定剂中足够长时间，以让固定剂能够渗透到组织的每个部分，然后再额外保留一段时间让固定化学反应达到平衡（固定时间）。通常，这意味着标本应该固定 6-24 小时（一般4 mm厚度以内的组织固定时间不宜超过24小时，固定时间过长，可能会影响后续基因检出结果）。
  固定后，待处理的标本将放在合适的贴标包埋盒（小孔篮）中，以便将其与其他标本隔离开。
  



• 3. 脱水

  熔化后的石蜡有疏水性（不可与水混溶），因此在浸蜡前，必须去除标本内的大部分水。一般通过将标本浸入一系列浓度渐增的乙醇（酒精）溶液直至达到纯净无水乙醇来进行这个过程。乙醇在所有比例下均可与水混溶，因此，标本中的水逐渐被乙醇替代。使用一系列渐增的浓度来避免组织过度变形。 对于厚度不超过 4mm 的标本，一般的脱水顺序为：（不同大小和类型的组织脱水条件均有不同，建议根据以往的组织类型处理经验调整浓度梯度和处理次数）
  1）70% 乙醇 15 分钟
  2）90% 乙醇 15 分钟
  3）100% 乙醇 15 分钟
  4）100% 乙醇 15 分钟
  5）100% 乙醇 30 分钟
  6）100% 乙醇 45 分钟
  此时，除了微量残留的强结合（分子）水外，应去除标本中所有的水。



• 4. 透明

  虽然组织现在基本上已经没有水分，但组织仍然无法被石蜡浸润，因为石蜡和乙醇很大程度上不混溶。因此，需要使用一种溶剂替换组织中的乙醇（一般选择使用二甲苯），然后二甲苯又能被熔化的石蜡取代。该过程中的这个阶段称为“透明”，选择“透明”一词，是因为许多（并非全部）透明剂会给组织带来透光或透明效果。透明剂的另一个重要作用是去除组织中的大量脂肪，否则脂肪会阻碍浸蜡。 对于厚度不超过 4 mm 的标本，一般的透明的处理顺序为：
  1）二甲苯 20 分钟
  2）二甲苯 20 分钟
  3）二甲苯 45 分钟



• 5. 浸蜡

  一般选用组织学实验专用石蜡，熔点为55℃~60℃，在此60℃下可浸润到组织中，然后冷却到 20°C，使其凝固。组织学专用石蜡是纯化石蜡和各种添加剂（可能包括树脂，如苯乙烯或聚乙烯）的混合物，具有非常特殊的物理特性，可使经蜡浸润的组织便于切成极薄的切片，并保留充分的弹性，并在温水浴上漂浮过程中完全变平。 对于厚度不超过 4 mm 的标本，一般的浸蜡处理顺序为：
  1.蜡 30 分钟
  2.蜡 30 分钟
  3.蜡 45 分钟



• 6. 石蜡包埋

  使用包埋模具进行组织包埋，模具内填充有熔化的蜡和标本。在模具中要非常小心地定向标本，因为它的放置方向将决定“切片平面”，这是空间转录组后续实验的重要考虑因素。
  将一个包埋盒（小孔蓝）放在模具顶部，加上更多的蜡，将整个组织块放在冷凝板上固化。完成这个操作时，带有附上的包埋盒的组织块可从模具中取出。
  
  

附件4：送样地址

收件人：诺禾致源样品组
电话：18526699037
邮寄地址：天津市武清开发区创业总部基地B07