1. 植物

• 1.1 植物样本说明

  • （1）植物样本主要包括禾本科植物、十字花科、常见作物、林木、常见蔬菜和花卉、中药、蕨类或苔藓。
    （2）样本的取材优先选择核酸含量相对较高的组织，幼嫩的组织最佳，如幼叶，幼芽。由于组培苗的愈伤组织DNA不稳定，组培苗在个别分析中不建议使用，如需使用请提前咨询销售或产品经理。
    （3）制备新鲜幼嫩组织样本、冻存幼嫩组织样本或幼苗活体样本时，要求选取新鲜幼嫩叶片或嫩芽组织部位，避免根茎组织。含多糖多酚的植物需要提前沟通送样时间，并备注样本为多糖或多酚，当天进行提取；长时间冻存样本提取得率差，尽量避免该类样本。
    （4）活体样本运输：选取幼嫩活体植株进行打包处理，减少运输途中对植物造成的伤害，送样前联系销售或运营，确保运送到诺禾公司后可至少成活3-5天。
    （5）冷冻样本运输：选取幼嫩无病虫害的组织部位（如幼叶），新鲜组织摘取后，立即进行表面消毒。可依次使用75%酒精冲洗-无菌水冲洗，用吸水纸吸干多余水份。使用剪刀去除木质化严重的部位（如叶脉）。液氮冻存前，进行分装。将组织放入预冷的冻存管、15ml或50ml离心管或者自封袋中，液氮速冻，然后-80℃保存。如用锡箔纸包装组织样品，折叠时需有纹理可循，并将锡箔纸放入自封袋中，避免打开锡箔纸时样品洒落，干冰运输。
    （6）建议在采集样本之前，将样本置于黑暗环境24-48小时后再制备样本。

• 1.2 常规植物组织样品（不同DNA文库）

  • 1.2.1 三代DNA测序

    部分物种样本组织量建议（去除包装后的重量），参考下表；其中用于Ultra long ONT测序样本：必须是嫩叶或嫩芽，如果物种种子萌发条件简单，可使用刚萌发的幼苗进行后续实验，如寄送种子到公司进行培育，需要附加培育说明。 6 3 3 12 1.5 6 3 3 12 1.5

    序号	种类	举例说明	测序平台及文库类型
    			Pacbio CCS文库（Hifi）	Pacbio CLR文库	Nanopore普通文库	Nanopore Ultralong文库	Bionano文库
    			每个cell建议样本送样重量（g）
    1	普通禾本科植物	水稻、玉米、小麦等	3	1.5	1.5	6	0.75
    2	豆科草本植物	大豆、苜蓿、落花生等	4	2	2	6	1
    3	豆科木本植物	黄檀、槐树、紫藤等	8	4	4	16	2
    4	蔷薇科水果	桃、李、苹果、梨、草莓等	4	2	2	8	1
    5	蔷薇科观赏植物	海棠、月季、蔷薇等	8	4	4	16	2
    6	壳斗科植物	栎树、槲树、栗等	10	5	5	20	2.5
    7	菊科植物	菊花、白术、莴苣等	8	4	4	16	2
    8	龙舌兰科植物	龙血树、晚香玉、丝兰等	8	4	4	16	2
    9	兰科植物	石斛、天麻、白及、蝴蝶兰等	8	4	4	16	2
    10	茅膏菜科（食虫植物）	瓶子草、捕虫草、茅膏菜等	10	5	5	20	2.5
    11	蕨类植物	桫椤、水韭等	8	4	4	16	2
    12	仙人掌科植物	火龙果、仙人掌等	10	5	5	20	2.5
    13	芭蕉科植物	香蕉、芭蕉、旅人蕉等	8	4	4	16	2
    14	苦苣苔科植物	苦苣苔、芒毛苣苔等	8	4	4	16	2
    15	紫草科植物	紫草、软紫草、狼紫草等	8	4	4	16	2
    16	三白草科植物	三白草、蕺菜等	8	4	4	16	2
    17	睡莲科植物	睡莲、莼菜、荷花等	8	4	4	16	2
    18	松科植物	马尾松、云杉等	6	3	3	12	1.5
    19	莎草科植物	油莎豆、莎草、荸荠等	10	5	5	20	2.5
    20	小檗科植物	桃儿七、小檗、淫羊藿等	6	3	3	12	1.5
    21	椴树科植物	黄麻、椴树、六翅木等	10	5	5	20	2.5
    22	五加科植物	人参、楤木、三七等	10	5	5	20	2.5
    23	瑞香科植物	狼毒、结香等	10	5	5	20	2.5
    24	薯类植物植物	木薯、番薯、土豆、蒟蒻等	4	2	2	8	1
    25	锦葵科植物	木槿、棉、锦葵等	6	3	3	12	1.5
    26	漆树科植物	盐肤木、南酸枣、黄栌等	10	5	5	20	2.5
    27	其他落叶乔木	杨树、梧桐、悬铃木等	8	4	4	16	2
    28	其他药用植物	益智、何首乌、列当等	10	5	5	20	2.5
    29	其他水果类	葡萄、柠檬、龙眼等	6	3	3	12	1.5
    30	其他植物	其他植物样本或非叶片类植物样本可以线下咨询

  • 1.2.2 Hi-C测序

    （1）组织样品需求量（单个Hi-C文库在Illumina平台最高200G）：>1g，送样量>3g最优；
    （2）样品制备：优选一叶或者两叶苗期的全部植株或者部分植物组织；对于富含多酚类的物种最好提供子叶组织；若为成熟植株，选择幼嫩叶，或是除幼嫩叶片外的其他幼嫩组织，避免根茎；其次是提供在黑暗条件处理2-3天的植物组织。

  • 1.2.3 BioNano测序

    （1）组织样品需求量（单cell，原始产出500G）：>1g，送样量>3g最优；
    （2）样品状态：优先选择低龄幼苗、组培苗（去除愈伤组织）；其次选择成熟植株的茎尖幼嫩叶片；
    （3）取样部位：种子培育的低龄幼苗、组培苗（去除愈伤组织）：全部叶片、部分幼嫩茎；
    （4）特殊注意点：对于客户需要保留茎尖的特殊情况，送样时无法取茎尖组织，可以取紧靠茎尖的第1-2片嫩叶；因为光学图谱对于样品自身杂质含量要求较严格，所以对于富含油脂（如松叶，柏枝等），多糖多酚（如地黄，棉花等）以及富含生物碱（如千层塔等中药材）的植株，最好准备黄化的种子幼苗或者组培苗。

• 1.3 特殊植物组织样品

  • （1）特殊植物样品类型：多糖多酚类植物，例如番薯；次生代谢产物较丰富的植物，例如中药材植物；生境潮湿的苔藓或水生植物；
    （2）样品制备：由于水生环境或潮湿环境，造成其容易有污染，因此需要注意取样后清理，排除外源污染，适当时需要进行抗生素培养；要求取新鲜幼嫩叶片或嫩芽，避免根茎组织，最好准备黄化的种子幼苗或组培苗。
    （3）其他内容可参考1.2中组织量等内容。

2. 脊椎动物

• 2.1 脊椎动物组织样本说明

  • （1）脊椎动物组织样本主要包括：哺乳动物（人类样本参考6）、禽类、爬行动物以及两栖动物。
    （2）送样需要选择新鲜采集的样本，尤其是Ultra long ONT建库，样本的取材优先选择核酸含量相对较高的组织，DNA测序用样本制备优先级：血液>内脏>肌肉。
    （3） 组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，客户应在寄送组织样品前进行备份。
    （4）应在冰上对DNA或RNA样品制备实验的组织样品处理及切割，尽可能快速进行，避免时间过长导致样品降解。
    （5）反复冻融和长期保存（-80℃保存时间6个月以上）的组织有高降解风险。寄送样本之前应确保样本没有被反复冻融，特别是动物肝脏，脾脏，肾脏，心脏，脂肪，脑，肿瘤等有较高RNA酶或DNA酶活性的组织。
    （6）对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有条件，请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。
    （7）特殊注意点：制备样本时需完成样品分装、解剖等处理，严禁寄送活体动物或未分装的样本，诺禾实验室不进行样品的解剖工作（如取昆虫的头部、动物的内脏等）。组织样品如需同时提取RNA和DNA，需要将样品进分装，分别送样。

• 2.2 脊椎动物组织样品（不同DNA文库）

  • 2.2.1三代DNA测序

    （1）样本类型及送样优先级：
    血液、细胞>肾脏>心脏>肝脏>肌肉等（不推荐性腺、脑等组织，代谢快易降解；不推荐耳缘、皮肤等样本，可能存在污染且测序质量差）；
    （2）部分物种样本组织量建议（去除包装后的重量）：

    序号	种类	样本类型或组织部位	测序平台及文库类型
    			Pacbio CCS文库（Hifi）	Pacbio CLR文库	Nanopore普通文库	Nanopore Ultralong文库	Bionano文库
    			每个cell建议样本送样重量（g）
    1	哺乳动物（人、羊、狗等）	抗凝血	4ml	2ml	4ml	10ml	2ml
    		活细胞	1*108个	1*108个	1*108个	1*109个	1*108个
    		实质脏器（肝、肾、脾等）	500mg	200mg	500mg	2000mg	200mg
    		空腔器官（输卵管、肠、胃等）	1g	500mg	1g	4g	500mg
    		肌肉	2g	1g	2g	8g	1g
    		皮肤	2g	1g	2g	8g	1g
    2	禽类（鸡、鸭、燕等）；爬行类（蜥蜴等）	抗凝血	0.5ml	0.3ml	0.5ml	1ml	0.3ml
    		活细胞	1*108个	1*108个	1*108个	1*109个	1*108个
    		实质脏器（肝、肾、脾等）	500mg	200mg	500mg	2000mg	200mg
    		空腔器官（输卵管、肠、胃等）	1g	500mg	1g	4g	500mg
    		肌肉	2g	1g	2g	8g	1g
    		皮肤	2g	1g	2g	8g	1g

    （3）样本制备：
    • a）组织取样前需准备足量液氮，预装样品的15 mL或50 mL冻存管，管盖需钻孔（防止管子内液氮体积膨胀爆炸），并在离心管内加满液氮，进行预冷； b）组织离体后需快速用预冷的0.9%生理盐水进行漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组织和毛发等非研究组织，将样品分割成50 mg左右的小块（约黄豆大小，组织块越小，保存效果越好），用吸水纸吸干后，立即浸入装有液氮的冻存管（螺旋帽的1.5 mL或2.0 mL的冻存管）中彻底冷冻；样品彻底冷冻后，再将样品转至-80℃保存；
    • b）组织离体后需快速用预冷的0.9%生理盐水进行漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组织和毛发等非研究组织，将样品分割成50 mg左右的小块（约黄豆大小，组织块越小，保存效果越好），用吸水纸吸干后，立即浸入装有液氮的冻存管（螺旋帽的1.5 mL或2.0 mL的冻存管）中彻底冷冻；样品彻底冷冻后，再将样品转至-80℃保存；
    • c）无法使用冻存管采集保存的样品，离体后仍需将样品立即浸入液氮彻底冷冻，再选用合适的容器包装，包装后需再浸入液氮中彻底冷冻一次，最后将样品转至-80 ℃保存。
    • d）避免将样品先放入离心管，再将离心管放到液氮中；不建议将样品直接保存于密封袋或不带螺纹旋盖的EP管中，因密封袋经过液氮速冻后变脆易破裂，易导致样品交叉污染，不带螺纹旋盖的EP管容易渗入液氮，导致管内体积膨胀爆管；避免装样太满以至冻裂，造成样品污染。
    • 

      冻存管示意图

      
      

      组织样本与重量示意图

  • 2.2.2 Hi-C测序

    （1）样品组织总量：肝脏、肾脏、脑、肌肉等组织>1g；脂肪组织>3g（脂肪组织较难处理，中间损失会较多）；细胞样本>10的6次方个细胞。
    （2）样品类型：采集于动物鲜活组织。组织优先级：细胞样本>肾脏>心脏>肝脏>肌肉等。
    （3）细胞系样品制备：
    • a）将组织准备成细胞系：胶原酶消化法制备单细胞悬液，组织处理：彻底去除表皮或毛发等杂质，用酒精擦拭表皮，获取无菌组织；放入加有1%-5% PS的PBS或者DMEM中，多次漂洗（10次左右，越多越好），剔除组织间的血管、结缔组织等，尽量得到纯净的组织，如肌肉，脂肪，真皮等；
    • b) 破碎组织：将处理干净的组织放入35mm培养皿中，用灭菌处理的剪刀剪碎至1立方毫米的组织碎块（尽量碎），然后转移到15ml的离心管或者灭菌处理的锥形瓶中；加入3-5倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃消化1h左右，直到组织变粘稠或澄清，观察细胞消化情况；再加入等体积0.25%胰酶消化5-15min，再次观察消化情况，可适当延长胰酶消化时间至20-30 min；将消化好的细胞依次用70 µm和40 µm滤膜过滤组织，得到细胞悬液；过滤后的细胞悬液用1000 rpm转速离心5 min，收集下层细胞；用3-5ml完全培养液重悬细胞，计数。
    （4）非细胞悬浮液样品制备：
    直接寄送组织：取新鲜的动物组织不低于1g（脂肪不低于3g），放入冻存管中，然后将冻存管放入液氮中速冻30min；如果组织块比较大，可以将组织放入密封袋中，然后用锡箔纸包裹起来，放入液氮中速冻30min；液氮速冻之后，转至-80℃保存。可参考2.2.1中“（3）样本制备”过程描述。 （5）样本运输：寄送时将样本管放入更大的管或者密封袋中，防止样本运输过程中被破坏，并用大体积干冰运输，保证诺禾开箱验收时有足够干冰剩余。

  • 2.2.3 BioNano测序

    （1）样本量：组织量30-50mg/管，送2管。 （2）样品类型：建议优先选择新鲜血液；其次是选择较嫩的器官，优先选择脾脏，肝脏，肾脏。 （3）样品运输：
    • a）冷冻前组织需要是新鲜的，从未解冻过的。如果组织已经大块冷冻，可切下30-50mg送样，操作全程需保持整块组织冷冻(可在液氮或干冰环境下进行切割)。如果不能切割，可整块组织送样，如有需要可安排后续返样。
    • b）将30-50mg组织块放入离心管或冻存管中，每管一块组织。如果组织新鲜，先切到合适的量后放到管中再速冻整管。将组织放入事先预冷的离心管中，液氮速冻，确保组织不会黏住管壁难以取出。
    • c）冻存管中的样本可放置在-80度冰箱保存，需要邮寄时干冰运输。
    • 注：Bionano一次提取至少需要10mg左右的组织，不同组织类型提取投入量可能不同，如本身组织量较少时，建议联系诺禾销售沟通。

• 1.3 特殊植物组织样品

  • （1）特殊植物样品类型：多糖多酚类植物，例如番薯；次生代谢产物较丰富的植物，例如中药材植物；生境潮湿的苔藓或水生植物；
    （2）样品制备：由于水生环境或潮湿环境，造成其容易有污染，因此需要注意取样后清理，排除外源污染，适当时需要进行抗生素培养；要求取新鲜幼嫩叶片或嫩芽，避免根茎组织，最好准备黄化的种子幼苗或组培苗。
    （3）其他内容可参考1.2中组织量等内容。

3 节肢动物

• 3.1 节肢动物组织样本说明

  • （1）节肢动物主要包括昆虫以及虾蟹类动物。
    （2）送样需要选择新鲜采集的样本，尤其是三代超长片段建库。某些吸血性昆虫，例如蚊子，血吸虫，该类型样本可能存在外源污染，需要进行切腹，去除肠道处理。
    （3） 组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，建议客户在寄送组织样品前进行备份。
    （4）取样操作需在冰上进行，避免样本的冻融，详细说明可参考（6）液氮冷冻方式详解。
    （5）反复冻融和长期保存的组织有更多的降解风险。客户应确保寄送之前组织没有被反复冻融。
    （6）液氮冷冻方式是多数组织样品选取的处理方法，详解如下：
    • a）组织取样前需准备好冷冻组织的足量液氮，预装样品的15 mL或50 mL冻存管，管盖需钻孔（防止管子内液氮体积膨胀爆炸），并在离心管内加满液氮；
      b）组织离体后需快速清洗，立即浸入装有液氮的冻存管中彻底冷冻（避免将样品先放入离心管，再将离心管放到液氮中）；样品彻底冷冻后，再将样品转至-80℃保存；
      c）无法使用冻存管采集保存的样品，离体后仍需将样品立即浸入液氮彻底冷冻，再选用合适的容器包装，包装后需再浸入液氮中彻底冷冻一次，最后将样品转至-80 ℃保存。
      注：客户在送样之前需做好样品分离、解剖等处理，严禁寄送活体动物，提取组不便进行样品的解剖工作（如取昆虫的头部、动物的内脏等）。组织样品如需同时提取RNA和DNA，建议将样品分两份送样。
    • 

      冻存管示意图

      
      

      组织样本与重量示意图

• 3.2 节肢动物组织样本

  • 3.2.1 三代DNA测序

    （1）例如蚂蚁、蚊子等个体较小的昆虫，进行体表清洁去除污染后，可直接放入冻存管中，液氮速冻；
    （2）例如蜜蜂、毛毛虫等个体较大的昆虫，解剖取活体组织后，用预冷0.9%生理盐水清洗后，吸干体表液体。将组织样本分成约50 mg左右。液氮速冻后，放入干净的冻存管中；
    （3）甲壳类节肢动物，例如对虾、螃蟹等，预冷0.9%生理盐水清洗活体组织，解剖后选取软组织，切割成50 mg的组织块（约黄豆粒大小），液氮速冻后置于冻存管中；
    （4）所有样本均需经液氮速冻后置于-80℃低温保存，并选择干冰运输寄送样本。

  • 3.2.2 Hi-C测序

    （1）样品类型：采集于动物鲜活组织。
    （3）样品运输：取新鲜的组织不低于1g，放入冻存管中，然后将冻存管放入液氮中速冻30min；如果组织块比较大，可以将组织放入自封袋中，然后用锡箔纸包裹起来，放入液氮中速冻30min；液氮速冻之后，转至-80℃保存。
    注：寄送组织时需要用足够的干冰，以保证组织在途中不融化。

  • 3.2.3 BioNano测序

    卵或幼虫，液氮速冻，-80℃保存，干冰运输，总量1g/管，送2管。

4 水产类

• 4.1 水产类组织样本说明

  • （1）水产类包括淡水鱼类、海水鱼类、贝类、藻类。
    （2）送样需要选择新鲜采集的样本，尤其是三代超长片段建库。海水类物种需要进行淡化处理。
    （3）组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，客户应在寄送组织样品前进行备份。
    （4）取样操作需在冰上进行，避免样本的冻融。

• 4.2 水产类组织样本

  • 4.2.1 三代DNA测序

    （1）部分物种样本组织量建议（去除包装后的重量）：

    序号	种类	样本类型或组织部位	测序平台及文库类型
    			Pacbio CCS文库（Hifi）	Pacbio CLR文库	Nanopore普通文库	Nanopore Ultralong文库	Bionano文库
    			每个cell建议样本送样重量（mg）或体积（ml）
    1	鱼类（海水鱼、淡水鱼等）；贝类；两栖类（蛙、大鲵、鳄鱼等）	抗凝血	0.5ml	0.3ml	0.5ml	1ml	0.3ml
    		活细胞	1*108个	1*108个	1*108个	1*109个	1*108个
    		实质脏器（肝、肾、脾等）	1g	500mg	1g	4g	500mg
    		空腔器官（输卵管、肠、胃等）	2g	1g	2g	8g	1g
    		肌肉	4g	2g	4g	12g	2g
    		皮肤	4g	2g	4g	12g	2g
    2	海洋软体动物	样本速冻前要保证样本处于较高的活力状态	4g	2g	4g	12g	2g

    （2）样本类型：
    样品采集时建议活体取材后用预冷的0.9%生理盐水进行漂洗，以去除血渍和污物，将样品分割成50 mg左右的小块（约黄豆大小，组织块越小，保存效果越好），样品分割和处理时应尽量在冰上进行，防止样品降解。避免装样太满以至冻裂，造成样品污染。
    （3）藻类样本：
    大型藻类送样量（干重）不少于3g，单细胞藻类（干重）不少于1g。建议藻类可提前使用抗生素处理。
    注：水产类样品需尽量保证为新鲜个体。尽量避免寄送保存时间较长或经过反复冻融的组织样品。针对软体动物可先使用75%的乙醇进行漂洗，无菌水去除酒精残留后液氮冷冻，干冰运输；针对刺胞动物，可去除头部和肠道等部位，保留肌肉外壁用于提取。

  • 4.2.2 Hi-C测序

    （1）动物组织样本类：
    • （a）样品类型：采集于动物鲜活组织。
    • （b）样品运输：取新鲜的组织不低于1g，放入冻存管中，然后将冻存管放入液氮中速冻30min；如果组织块比较大，可以将组织放入自封袋中，然后用锡箔纸包裹起来，放入液氮中速冻30min；液氮速冻之后，转至-80℃保存。
    • 注：寄送组织时需要用足够的干冰，以保证组织在途中不融化。
    （2）单细胞藻类样本：
    • （a）需要量：最低要求每次2×106，每份不超过2×107个细胞。请注明样品提交表格每个样品细胞的总数量。建议发送多份（2-3）样品，允许重复提取。 
    • （b）样品准备：选择新鲜的单细胞藻类，使之保持存活。
    • （c）运输方式（室温）：将藻类置于培养液中，用隔温容器运输（为避免极端的外界温度影响），运输时间12小时~2天。

  • 4.2.3 BioNano测序

    （1）藻类样本：单细胞藻类按照1个plug需要包埋9x105，如果包埋5 plug，建议细胞量为5x106个。 （2）组织样本：选择娇嫩的组织部位。取出的组织液氮速冻，-80℃保存，干冰运输。组织量500mg/管，送两管。 （3）鱼类血液样本：新鲜采取的血液，要加抗凝剂，抗凝剂可以根据客户自己平常的研究来确定。血液一般需求量为100ul/管，送2管。采样后，请妥善-80℃保存好，运输到实验室前不能有过冻融。取好的样品一周内送到实验室，超过一周请重新准备样本。

5 血液样本

• 5.1 血液样本说明

  新鲜血样或是冻存血样均需要使用EDTA抗凝管进行采集并与抗凝剂充分混合，血液样本不建议保存时间过长。

• 5.2 三代DNA测序

  （1）样本用量详见表格。

  序号	种类	样本类型或组织部位	测序平台及文库类型
  			Pacbio CCS文库（Hifi）	Pacbio CLR文库	Nanopore普通文库	Nanopore Ultralong文库	Bionano文库
  			每个cell建议样本送样重量（mg）或体积（ml）
  1	哺乳动物（人、羊、狗等）	抗凝血	4ml	2ml	4ml	10ml	2ml
  2	禽类（鸡、鸭、燕等）；爬行类（蜥蜴等）	抗凝血	0.5ml	0.3ml	0.5ml	1ml	0.3ml
  3	鱼类（海水鱼、淡水鱼等）；贝类；两栖类（蛙、大鲵、鳄鱼等）	抗凝血	0.5ml	0.3ml	0.5ml	1ml

  （2）要求为全血样本，并加入抗凝剂，推荐使用EDTA抗凝的采血管收集样品（由于会影响实验，不能使用肝素抗凝），并将其放入50ml离心管中(以防冻存过程中发生采血管冻裂，导致血液损失)；-80℃冷冻后，干冰运输。
  （3）血液样本一定要避免反复冻融，如果血液放置时间过长，或经历过反复冻融，请务必提前沟通，以尽量保证血液样本核酸提取质量。因放置过久或经历过反复冻融的样本经常会发生细胞核破裂，核酸游离于血浆中。
  （4）血液样品应使用塑料材质的采血管送样，避免使用玻璃材质采血管送样或装液太满，以至冻裂。
  （5）新鲜血液样本：推荐 EDTA 抗凝采血管收集样品，或加EDTA或柠檬酸钠抗凝剂保存，4℃保存，冰袋运输（需在1天内送到）。
  （6）加入抗凝剂后的新鲜血液一般可以在4℃放置12-24小时，但经过速冻后的样本一定要低温保存。

• 5.3 Hi-C测序

  （1）样品总量：全血需提供分离并固定好的淋巴细胞，细胞量≥2.0×106/次。
  （2）所需试剂：37%甲醛（sigma），Glycine(amresco)，Lymphoprep(Stemcell)。
  （3）分离淋巴细胞:
  
  • a）取15ml Lymphoprep于50ml离心管中，将2ml的新鲜血液缓慢平铺于上层（平铺血液时将离心管倾斜一定角度缓慢注入，避免两种液体混合在一起），800g 4℃离心20min。
    b）经离心后，液体分层，PBMC所在的细胞层为白色，用移液器小心吸取该层细胞将其转移到干净的50ml的离心管中，避免吸到红细胞层。
    c）加入1xPBS至30ml，300g，10min离心去上清；加入少量1xPBS，用手指轻弹重悬沉淀后再加满至30ml，5000g离心5min后去上清；重复一次。
    d）加入1xPBS至10ml，进行细胞计数。（细胞数量需要≥2M）。
  （4）固定：
  
  • a）在10ml的细胞悬液中，加入571µl 37%甲醛混匀（终浓度为2%），室温放置15min（每1、2分钟混匀一次）。加入1.14mL 2.5M甘氨酸混匀终止交联，室温放置5min，（每1、2分钟混匀一次），然后冰上放置15min。
    b）将细胞悬液用500g 4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀可以储存在-80℃。
  （5）干冰寄送：寄送细胞时需要足够的干冰，以保证细胞在途中不融化。

• 5.4 BioNano测序

  • 5.4.1 血液（动物或人）样本

    （1）当新鲜血液采集后运输并可在5天内运达诺禾的话，请参照如下指导：
    • a）用EDTA管采集血液。采集后的血液可放置到采血管混匀仪室温混匀15min，或手动轻柔缓慢颠倒混匀15次，确保无凝血现象。保证与抗凝剂的充分混匀，确保无凝血现象。
    • 注：Bionano提取需要1.5×106个白细胞作为提取的起始量。全血样本与抗凝剂充分混合，避免凝血现象，保证足够的白细胞数量，是全血样本提取成功的关键。
    • b）采血用封口膜封口后保存在4℃，使用4℃冰袋运输（请勿使用-20℃冰袋）。
    （2）新鲜血液打包运输指南
    • a） 将采血管放入密封袋中，密封袋内放置吸水纸（目的是吸附意外泄露的血液）。切勿用纸巾包裹采血管。
    • b） 使用泡泡纸松松地包裹密封袋。不要用胶带直接包裹或钉密封袋。
    • c） 将打包好的采血管放入体积足够的聚苯乙烯泡沫箱中，放入足够的冰袋（4℃），保证运输过程低温。如有需要，加入缓冲材料。使用最快速的运输服务进行运输。
    • 注：新鲜血液必须在采血5天内运达。如果不能够在5天内运达，则尽快冷冻血液（参考如下冷冻血液运输指南）新鲜血液，EDTA抗凝，5-10ml。
    （3）冷冻血液采集及预处理指南
    • 推荐将采集后充分抗凝的血液进行分装，以便进行后续储存和运输。每管分装650ul-1ml全血（针对不含有带核红细胞的血液）。一次提取仅需要一管分装血液，推荐额外送样一管作为备份。
    • 将血液进行分装，每个冻存管分装650ul-1ml血液。将每份血液尽快放到-80℃冰箱冷冻。如条件不具备的话，最晚在采血后4天内完成冷冻。
    • 注：如果血液已经冷冻，切勿为了分装而解冻。可将整管血液送样，如有需要可安排返样。冷冻全血样本需要保证从冷冻之日起，恒定保存在-80℃，没有经历过样本化冻。
    （4）冷冻血液打包运输指南
    • a） 分装后的冷冻管口需用封口膜包裹，将所有样品管放到密封袋中；
    • b） 用泡泡纸松松地包裹密封袋，不要用胶带直接包裹或钉密封袋。
    • c） 使用可放下合适体积的干冰和样品的聚苯乙烯泡沫箱，确保运输过程干冰量足够。使用最快速的运输服务进行运输。

  • 5.4.2 鱼血（或水生动物血液）样本

    新鲜采取的血液，要加抗凝剂，抗凝剂可以根据客户自己平常的研究来确定。采样后，请妥善-80℃保存好，运输到实验室前不能有过冻融。取好的样品一周内送到实验室，超过一周请重新准备样本。

6 人

• 6.1人组织样本说明

  • (1)送样需要选择新鲜组织或冰冻组织，尽量选择新鲜组织，尤其是三代超长片段建库。
    (2)组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，客户应在寄送组织样品前进行备份。
    (3)用于DNA或RNA样品制备实验的组织样品处理及切割过程应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品降解。
    (4)反复冻融和长期保存的组织有更多的降解风险。客户应确保寄送之前组织没有被反复冻融，特别是肝脏，脾脏，肾脏，心脏，脂肪，脑，肿瘤等有较高RNA酶或DNA酶活性的组织。
    (5)癌症研究需同时取肿瘤样本和正常对照。肿瘤样本尽量保证组织中恶性肿瘤细胞所占比例较大，至少超过50%。正常对照首选血液样本，次选癌旁对照。
    (6)对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。
    (7)液氮冷冻方式是多数组织样品选取的处理方法，详解如下：
    • a）组织取样前需准备好冷冻组织的足量液氮，预装样品的15 mL或50 mL冻存管，管盖须钻孔（防止管子内液氮体积膨胀爆炸），并在离心管内加满液氮；
      b）组织离体后需快速清洗，立即浸入装有液氮的冻存管中彻底冷冻（避免将样品先放入离心管，再将离心管放到液氮中）；样品彻底冷冻后，再将样品转至-80℃
      c）无法使用冻存管采集保存的样品，离体后仍需将样品立即浸入液氮彻底冷冻，再选用合适的容器包装，包装后需再浸入液氮中彻底冷冻一次，最后将样品转至-80℃保存。
      注：客户在送样之前需做好样品分离、解剖等处理。组织样品如需同时提取RNA和DNA，建议将样品分两份送样。

• 6.2 人组织样本

  • 6.2.1 三代DNA测序

    (1)样本量：样本总量（干重）：1-2g（黄豆粒大小，1-2粒）。细胞系样本：不低于5*10的6次方个细胞。
    (2)部分样本类型或组织部位送样建议：

    序号	种类	样本类型或组织部位	测序平台及文库类型
    			Pacbio CCS文库（Hifi）	Pacbio CLR文库	Nanopore普通文库	Nanopore Ultralong文库	Bionano文库
    			每个cell建议样本送样重量（mg）或体积（ml）
    1	人	抗凝血	4ml	2ml	4ml	10ml	2ml
    		活细胞	1*108个	1*108个	1*108个	1*109个	1*108个
    		实质脏器（肝、肾、脾等）	500mg	200mg	500mg	200mg	200mg
    		空腔器官（输卵管、肠、胃等）	1g	500mg	1g	4g	500mg
    		肌肉	2g	1g	2g	8g	1g
    		皮肤	2g	1g	2g	8g	1g

    (3)组织大小实例：
    (5)组织样本准备：采集组织后立即用预冷的0.9%生理盐水进行漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组织和毛发等非研究组织，将样品分割成 50 mg左右的小块（约黄豆大小，组织块越小，保存效果越好），立即液氮速冻，冻存后放入预冷的带螺旋帽的1.5 mL或2.0 mL的冻存管中（不建议将样品直接保存于密封袋或不带螺纹旋盖的EP管中，因密封袋经过液氮速冻后变脆易破裂，易导致样品交叉污染，不带螺纹旋盖的EP管容易渗入液氮，导致管内体积膨胀爆管），然后用封口膜封口，-80℃保存。样品分割和处理时应尽量在冰上进行，防止样品降解。避免装样太满以至冻裂，造成样品污染。
    (6)细胞样本准备：加细胞冻存液（血清+10% DMSO），液氮慢冻或收集得到细胞沉淀，液氮速冻。
    (7)样本运输：寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中，防止样本运输过程中被破坏，并用大体积干冰运输，保证诺禾开箱验收时有足够干冰剩余。
    (8)其他：如果计划采用组织内核酸稳定剂保存样本，请严格按照试剂说明书要求规范操作，取材时使组织块保持在试剂要求的大小范围，以保证试剂充分渗透，以免引起降解。

  • 6.2.2 Hi-C测序

    (1)样品总量：肝脏、肾脏、脑、肌肉等组织不低于1g；脂肪组织不低于3g（脂肪组织较难处理，中间损失会较多）；细胞样本：不低于10的6次方个细胞。
    (2)样品类型：采集于新鲜组织。组织优先级：细胞样本>肾脏>心脏>肝脏>肌肉等。
    (3)样品运输：
    • a）直接寄送组织：取新鲜的组织不低于1g（脂肪不低于3g），放入冻存管中，然后将冻存管放入液氮中速冻30min；如果组织块比较大，可以将组织放入自封袋中，然后用锡箔纸包裹起来，放入液氮中速冻30min；液氮速冻之后，转至-80℃保存。
      b）将组织准备成细胞系：胶原酶消化法制备单细胞悬液，组织处理：彻底去除表皮毛发等杂质，用酒精擦拭表皮，获取无菌组织；放入加有1%-5% PS的PBS或者DMEM中，多次漂洗（10次左右，越多越好），剔除组织间的血管、结缔组织等，尽量得到纯净的组织，如肌肉，脂肪，真皮等；
      c) 破碎组织：将处理干净的组织放入35mm培养皿中，用灭菌处理的剪刀剪碎至1立方毫米的组织碎块（尽量碎），然后转移到15ml的离心管或者灭菌处理的锥形瓶中；加入3-5倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃消化1h左右，直到组织变粘稠或澄清，观察细胞消化情况；再加入等体积0.25%胰酶消化5-15min，再次观察消化情况，可适当延长胰酶消化时间至20-30 min；将消化好的细胞依次用70 µm和40 µm滤膜过滤组织，得到细胞悬液；过滤后的细胞悬液用1000 rpm转速离心5 min，收集下层细胞；用3-5ml完全培养液重悬细胞，计数。
      注：寄送组织时需要用足够的干冰，以保证组织在途中不融化。

  • 6.2.3 BioNano测序

    (1)样本量：组织量30-50mg/管，送2管。
    (2)样品类型：建议优先选择新鲜血液；其次是选择娇嫩的器官，优先选择脾脏，肝脏，肾脏。
    (3)样品运输：
    • a）冷冻前组织需要是新鲜的，从未解冻过的。如果组织已经大块冷冻，可切下30-50mg送样，操作全程需保持整块组织冷冻(可在液氮或干冰环境下进行切割)。如果不能切割，可整块组织送样，如有需要可安排后续返样。
      b）将30-50mg组织块放入离心管或冻存管中，每管一块组织。如果组织新鲜，先切到合适的量后放到管中再速冻整管。将组织放入事先预冷的离心管中，液氮速冻，确保组织不会黏住管壁难以取出。
      c）冻存管中的样本可放置在-80摄氏度冰箱保存，需要邮寄时干冰运输。
      注：Bionano一次提取至少需要10mg左右的组织，不同组织类型提取投入量可能不同，如本身组织量较少时，建议联系诺禾销售沟通。

7 核酸样本（DNA）

• 7.1 核酸样本说明

  • 7.1.1 核酸样本检测方法

    客户在核酸样本寄送前，需提供样本基本质控结果，常见样本质控包括Qubit®、NanoDropTM、AGE（琼脂糖凝胶电泳）或者Agilent 2100中一种或多种形式的样品分析结果。

  • 7.1.2 核酸样本检测项目及说明

    v：体积（Volume），样品（溶液）体积。
    m：总量（Total Mass），DNA或RNA总量。
    c：浓度（Concentration），DNA或RNA浓度。
    28S/18S：28S/18S比值，真核生物rRNA中28S与18S比值，反映真核RNA完整性。
    28S/16S：28S/16S比值，原核生物rRNA中28S与16S比值，反映原核RNA完整性。
    OD260/280：OD260/280比值，DNA或RNA检测中260与280吸光度值比，反映DNA或RNA纯度。
    OD260/230：OD260/230比值，DNA或RNA检测中260与230吸光度值比，反映DNA或RNA纯度。
    样品分类 Pass：合格，质量满足三代建库要求。
    Fail：样品质量不满足建库测序要求，不建议使用。

  • 7.1.3 核酸样本制备要求

    (1) 提取好的基因组 DNA 应溶解于不含有 EDTA 的 PH 8.0 缓冲液中，可溶解于 10mM Tris-Ac、Tris-HCl 或 ddH2O 中。
    (2) 样品溶液澄清无色，无不可溶解物质，无 RNA 污染。
    (3) 不含螯合剂（如 EDTA），二价金属阳离子（如 Mg2+），变性剂（如胍盐, 苯酚）、去污剂（如SDS，Triton-X100），不含生物组织中的污染物（如血红素、腐殖酸、多酚）。
    (4) 样品避免接触紫外线、荧光染料等可能损伤 DNA， 如过样本需要切胶纯化， 请使用 SYBR®Safe (Invitrogen) 染料并使用蓝光成像。
    (5) 样品不要暴露在高温（＞65℃ 1 h 以上）或极性环境中（pH＜6 或 pH＞9） 如果样本来源生物的生存环境属于极端环境，提取样品前请与我方沟通提取方案。
    (6) 样品切忌反复冻融，运输过程务必全程保持低温4℃，如果基因组易降解情况严重，建议联系诺禾致源销售沟通。
    (7) 风险与建议：
    总量不足或浓度过低存在以下风险：a）文库构建可能失败；b）文库产量低不能上机测序或测序数据不足；c）影响文库随机性、数据覆盖度偏低。因此对于核酸总量不足、过低或降解的样本，若仍需要建库，则请自行承担责任与风险。 降解样品：影响文库随机性，可造成duplication偏高等。

• 7.2 三代建库

  由于三代测序对样本质量要求较高，请务必按照以下送样标准，并仔细纯化样本，尽量避免多糖、蛋白质等残留。样本需要标注溶剂成分，溶解DNA的缓冲液不可含有EDTA，核酸样本不许含有以下物质：颗粒物质、螯合剂、二价金属阳离子、变性剂和洗涤剂、荧光染料，不得是EB凝胶回收产物。具体要求参见7.1。

  文库类型	Pacbio三代文库	nanopore三代文库	nanopore Ultra long文库
  总量	≥10ug（一次建库）	≥10ug（一次建库）	≥40ug（一次建库）
  主带	≥40kb	≥40kb	≥100kb
  纯度	260/280 需在 1.8-2.0 之间，A260/230 在 1.9-2.4 之间
  纯度	≥80ng/μl
  NC/QC	0.95-3.0

  注：NC:QC 样品 NanoDrop 所测浓度与 Qubit 所测浓度比值；含乙醇的DNA样本需提前告知。
  （1）样品运输：DNA可溶解在TE buffer或ddH2O中，样品送样前需保持在4℃，冰袋邮寄，或根据具体情况用干冰邮寄，切忌反复冻融；
  （2）样品检测：对于收到的DNA样品，诺禾致源将用1 µl的DNA去检测浓度（Nanodrop和Qubit分别检测），用200 ng的DNA去上样，用脉冲电泳检测条带大小，如样品不符合建库要求会尽快将结果反馈给客户。